夏金成 阙彤彤 张文君 赵聪 杨秦
(邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000)
不同营养条件下维罗纳气单胞菌菌毛表达与生物膜形成能力的比较
夏金成 阙彤彤 张文君 赵聪 杨秦*
(邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000)
目的:检测不同培养基条件下(即不同营养条件下)维罗纳气单胞菌菌毛动力和生物膜生成能力(即致病能力)。方法:半固体培养基穿刺阳培养检测细菌动力,喉上皮细胞粘附实验检测生物膜形成能力,最后统计分析差异性。结果:BHIB培养基比LBA培养基中,野生型都比菌毛缺失的MSHB突变维罗纳气单胞菌有更高的动力和生物膜形成能力,但之间都无显著差异(P<0.05)。结论:不同培养基基条件对菌毛动力有影响,而菌毛表达对生物膜致病性有一定关系。
维罗纳气单胞 菌毛 半固体穿刺 粘附
生物膜多细胞结构的形成是一个复杂且高度规律的动态过程,包括细菌起始黏附、生物膜黏附期、生长期、成熟和播散期等阶段[1]。首先, 游动细胞接受环境中的营养信号, 通过鞭毛或菌毛等附着结构黏附于表面; 附着于表面后的细菌不断繁殖并吸引其他细菌继续附着, 使该附着位点细菌呈高密度状态从而产生抗生素抵抗性[2]。鞭毛、菌毛介导的动力性和黏附性在细菌致病性中发挥重要作用, 其与细菌的生物膜形成、耐药性和慢性感染中的相关性日益受到医学界的重视[3]。本次实验通过检测不同培养基条件下(即高低营养差别条件下)维罗纳菌菌毛对动力和有机体细胞粘附的作用,探讨细菌菌毛对生物膜形成的起始黏附、生物膜黏附期的意义。为抗菌,制药做出基础贡献。
1.1 菌种
本次采用的是两种维罗纳气单胞菌:MSHB+(野生型有菌毛)和MSHB-(基因突变型无菌毛)。这两种细菌均来源以前研究工作的保种。它们有鞭毛表达,只在菌毛表达上有差异。
1.2 细菌培养基和生长条件
BHIB和LBA培养基分别是相对高和相对低营养状态的培养基。维罗纳气单胞菌被分别放在不同培养基中37℃培养,等到细菌长到对数生长期后,用于接下来的半固体培养基穿刺和生物膜形成能力实验。
1.2 免疫印迹
1.2.1 细菌菌毛蛋白的收集
首先将两种培养细菌用PBS洗涤三次,再将每种细菌悬浮在1mlPBS溶液中。把此PBS溶液吸入皮下注射器,并对着eppendorf管壁反复挤出和吸入。最后在13200转/分钟,室温条件下离心25分钟,以分离细菌和菌毛蛋白。紧接着加入缓冲溶液,煮沸变性。最后再离心一分钟,把上层溶液用于跑胶。
1.2.2 SDS-PAGE电泳
按照普通的8%的胶的方法配制凝胶,跑胶。
1.3 半固体培养基穿刺培养实验
1.3.1 半固体培养基配制
琼脂4g/l,牛肉膏粉末3 g/l,蛋白胨5g/l,氯化钠5 g/l,调节pH=7.4。混匀溶解后,以3厘米为高度分装于玻璃试管中。将分装后的玻璃试管用锡箔纸包住封口。高温高压灭菌,放凉。
1.3.2 细菌接种
在超净工作台中,用接种针将不同的细菌分别接种在灭菌后的半固体培养基中。穿刺深度以试管中琼脂高度的1/2-3/4为宜。穿刺轨迹你应循原路退出,刺入及拔出时要接种针不向穿刺线外摆动。穿刺后封口,37℃培养,72小时观察结果。如有细菌沿着穿刺线扩散,那么细菌就有动力。每种菌株重复50次。
1.4 喉上皮细胞粘附实验(生物膜形成能力检测)
将两种不同细菌接种在两种不同培养基中。喉上皮细胞粘附实验的方法与之前报道的方法一致[4]。
1.5 SPSS统计分析。
使用SPSS19.0软件进行相关统计分析。
结果表明野生型(MSHB+)有菌毛而突变型(MSHB-)没有。βactin是内参。
表1 半固体培养基穿刺实验
图1 菌毛蛋白表达的免疫印迹
图2 喉上皮细胞粘附实验
结果表明野生型(MSHB+)比突变型(MSHB-)维罗纳气单胞菌有更强动力,但之间并无显著区别(p<0.05)。
结果表明在两种不同培养基中(相对高营养的BHIB和相对低营养的LBA),野生型(MSHB+)比突变型(MSHB-)维罗纳气单胞菌都具有更强粘附能力,但无论哪一种之间并无显著区别(p<0.05)。
生物膜是细菌在表面生活时采取的一种生长方式, 它是细菌的一种本能, 尤其适合细菌在不利环境中生存,对细菌产生保护作用; 生物膜最重要的特性是对抗生素的高度耐药性[5],它能够有效地阻挡药物作用于膜内的细菌。生物膜与临床中、西药耐药性是目前研究的热点。本次实验结果(表1)证明,有菌毛表达的维罗纳气单胞菌有更强的动力,而更强动力的细菌更能粘附宿主细胞(图2)。基于菌毛、粘附和生物膜形成之间的关系。通过本次研究,我们揭示了维罗纳菌菌毛部分的致病能力,为药物开发等研究奠定一定基础。
[1]Butler M T,Wang Q,Harshey R M.Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.J Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(8):3776-81.
[2]Merino S,Shaw J G,Tomas J M.Bacterial lateral flagella: an inducible flagella system.J FEMS Microbiol Lett, 2006, 263(2):127-35.
[3] Giron J A,Levine M M,Kaper J B.Longus: a long pilus ultrastructure produced by human enterotoxigenic Escherichia coli.J Mol Microbiol,1994,12(1):71-82.
[4]Thornley,J.P.,Shaw,J.G.,Gryllos,I.A.& Eley,A. (1997)Virulence properties of clinically significant Aeromonas species:evidence for pathogenicity.Review in Medical Microbiology,8,61-72.
[5]Van Houdt R,Michiels C W.Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation.J Res Microbiol,2005,156(5-6):626-33.
Q2
A
1674-2060(2016)03-0005-01
课题来源: 2015年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(653);2015年度湖南省教育厅科研项目(15C1255)。
夏金成, 阙彤彤, 张文君, 赵聪,邵阳医学高等专科学校2014级检验专业学生。
杨秦(1981—),男,讲师,主要研究方向为生物化学与分子生物学。