孙雨薇闫冬梅
(1.中国人民解放军第209医院 黑龙江牡丹江 157011;2.佳木斯大学基础医学院免疫教研室 黑龙江佳木斯 154007)
五味子多糖对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响
孙雨薇1闫冬梅2*
(1.中国人民解放军第209医院 黑龙江牡丹江 157011;2.佳木斯大学基础医学院免疫教研室 黑龙江佳木斯 154007)
[目的]研究五味子多糖(SCP)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。[方法] 不同浓度SCP作用于SMMC-7721,cck-8法检测药物对细胞增殖的影响;Tunnel检测细胞凋亡变化。[结果]SCP能够抑制肝癌细胞的增殖。荧光显微镜下可见细胞呈现典型的凋亡细胞形态。[结论]SCP能抑制肝癌细胞的增殖,诱导凋亡。但详细机制尚需进一步研究。
五味子多糖 SMMC-7721细胞 细胞凋亡
五味子多糖(SCP)是中药五味子的主要有效成分之一,具有较好的抑瘤作用[1]。本研究探讨SCP对SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响,从而为肝癌的治疗提供实验依据。
1.1 细胞株
人肝癌SMMC-7721细胞株,本研究室保存。
1.2 药品
SCP购自宁夏宏德生物制品有限公司,用RPMI 1640培养液溶解成 200 mg/mL的储备液,过滤除菌, 4 ℃保存,实验时加培养液稀释至所需浓度。
1.3 试剂
RPMI 1640购自美国Hyclone 公司,新生牛血清购自杭州四季青公司,胰蛋白酶、CCK-8、Tunnel试剂盒、Hoechst33342购于碧云天生物技术研究所。
1.4 主要仪器
MCO-15AC恒温CO2培养箱(日本SANYO公司);Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜、DXM 1200 C数码相机(尼康公司);Multiskan Mk3酶标仪(Thermo公司)。
2.1 细胞培养
SMMC-7721细胞培养于含10%灭活新生牛血清RPMI 1640培养基,37 ℃、5% CO2饱和湿度下常规培养,0.25%胰蛋白酶消化传代,每2-3 d传代1 次。
2.2 CCK-8法检测细胞增殖
SMMC-7721细胞经胰酶消化,以5×105个/mL接种于96孔板,每孔200 μL,37℃、5%CO2培养。当细胞融合达80%时,分别加入SCP(终质量浓度为0,0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/mL),每个浓度3复孔,分别培养24,48,72 h加入CCK-8试剂,每孔20 μL,继续培养3 h,450 nm波长检测各孔A (吸光度)值,实验重复3次。计算细胞生长抑制率(IR):IR(%)=(1- 实验组A均值/对照组A均值)×100%。计算各组药物的半数抑制率 IC50。
图1 给药48 h后SMMC-7721细胞凋亡结果(Tunnel染色)
2.3 Tunel染色法检测细胞凋亡
SMMC-7721细胞接种于6孔板中,每孔加3 mL培养液,于37℃、5%CO2培养。分为SCP组(10 mg/mL)和对照组(SMMC-7721),每组3复孔。培养48 h,PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定30 min; PBS洗涤,加入0.1% TritonX-100 PBS冰浴2 min。PBS洗涤细胞后移入湿盒中,加入100 μL的Tunnel检测液(现配现用),37℃避光60 min。PBS洗涤细胞,37℃下Hoechst33342染色40 min;PBS洗涤,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,拍照。
2.4 统计学分析
3.1 SCP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用
各剂量组SCP对SMMC-7721细胞生长均有抑制作用,呈现一定程度的剂量依赖性,差异有统计学意义( P<0.001或 P<0.01)。5 mg/mL以上抑制率随时间延长而逐渐提高,呈时间依赖性。10 mg/mL SCP在48、72 h抑制率分别为51.59%、60.14%,20 mg/ mL SCP在24、48、72 h的抑制率分别达到67.08%、79.99%、92.44%,说明SCP体外对SMMC-7721细胞确实具有抑制作用。经计算,24, 48,72 h的 IC50分别为16.48,11.12,9.09 mg/mL,故后续实验使用浓度为10 mg/mL的剂量,药物作用时间为48 h。
3.2 SCP对凋亡细胞形态学的影响
荧光显微镜下可见,对照组细胞核染色正常,极少有标记凋亡细胞的绿色荧光;给药组细胞核基本没有破裂,但能观察到较多标记凋亡细胞的绿色荧光(图1)。
研究发现,SCP对S180荷瘤小鼠有抑瘤作用,使凋亡增加,瘤内炎细胞增多,瘤周炎细胞浸润增加,瘤细胞异型性降低,核分裂像减少,瘤细胞退变明显[2]。于赫[3]等发现SCP对H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤具有重要作用。因此,SCP具有预防和治疗肿瘤的潜在价值。
本研观察了不同浓度五味子多糖对SMMC-7721细胞的影响,结果发现,五味子多糖可抑制细胞增殖和诱导凋亡。说明五味子多糖可以在体外通过诱导SMMC-7721细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖发挥抗肿瘤作用,可能在治疗肝癌上发挥一定的作用。但其抗肿瘤的具体机制还不清楚,仍待进一步研究。
[1]张兰杰,张维华,赵珊红.北五味子果实中多糖的提取与纯化研究[J].鞍山师范学院学报,2002,4(1):58-60.
[2]黄玲,陈玲,张振林.五味子多糖对荷瘤鼠瘤体抑制作用的病理学观察[J].中药材,2004,24(3):202-203.
[3]于赫,李冀,齐彦.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其免疫学机理初探[J].中医药信息,2010,27(2):26-24.
R285.5
A
1674-2060(2016)03-0200-01
孙雨薇(1983—),女,主管药师,主要从事药品配制与检验及免疫学的研究。
闫冬梅,硕士,副教授,主要从事疫苗的免疫学评价和中草药免疫的研究。