RP-HPLC法测定大果山楂果实中四种氨基酸的含量

祁佳佳，杨嘉怡，范亚梦，李典鹏，王先友*

(1.河南大学 药学院,河南 开封 475004； 2.广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西 桂林 541006)

大果山楂为蔷薇科苹果亚科苹果属植物台湾林檎[Malusdoumeri(Bois)Chev.]和光萼林檎(MalusleiocalycaS.Z.Huang)的成熟果实[1],主要来源于台湾林檎,它又名乌婵子(广西苗语)、麻缺顿、撒多、广山楂(商品名)等。主要分布于云南富宁、西畴和广西德保、靖西、那坡，广西东兰及天峨也有少量引种[2]。大果山楂性味甘、酸、涩、味温，与我国传统中药山楂(北山楂)有相似的成分和功效[3]，富含营养，包括丰富的氨基酸、维生素、鞣质、多酚、微量元素、黄酮类、熊果酸和单宁等[4]。具有理气健脾、消食导滞、预防肿瘤、降压、抑菌、抑制自由基、抗氧化和提高免疫力等保健功效。其果皮青黄色，果肉白色，肉质细嫩，果实大且肉厚，气味清香。鲜食酸涩，现主要被加工成山楂粉、干片、果脯、醋、山楂酒、茶等系列食品[3]。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，是人体不可缺少的物质。由蛋白质水解所得到的α-氨基酸共有20多种[5]，α-氨基酸一般能溶于酸性或碱性水溶液中，但难溶于极性小的有机溶剂。因此采用合适的方法完全提取氨基酸，对后续含量测定很重要。

大果山楂富含氨基酸、黄酮类和三萜类等药物成分，具有降压和显著扩张血管的作用，能增加心肌收缩力、抗心律不齐、降低甘油三酯和胆固醇[6-7]。目前对大果山楂的活性成分和药理作用、工艺研究等方向研究较多[8-9]，对大果山楂氨基酸含量测定较少。因此，本实验对大果山楂中苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸和亮氨酸的含量进行分析研究，为大果山楂的开发利用提供科学依据。

1 仪器、试剂及材料

1.1 仪器

HPLC色谱仪(日本岛津，LC-20A)；紫外检测器(日本岛津，SPD-20A)；色谱柱(Agilent公司，Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；电子分析天平(ESJ200-4B，沈阳龙腾电子有限公司)。

1.2 试剂

苯丙氨酸，组氨酸，酪氨酸，亮氨酸(含量98%，供含量测定用，阿拉丁)。甲醇(色谱纯，科密欧)，其余试剂均为分析纯。

1.3 材料

大果山楂果实采自广西靖西,经广西植物所李典鹏研究员鉴定为苹果属大果山楂[Malusdoumeri(Bois)Chev.]的果实，干燥后粉碎，过40目筛。

2 方法与结果2.1 溶液的配制2.1.1 对照品储备溶液

精密称取苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸对照品各约0.01 g，亮氨酸0.02 g分别置于4个10 mL量瓶中，均用蒸馏水定容，摇匀，得对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液

在确定氨基酸的提取条件时，参考了多篇关于氨基酸含量测定条件筛选的文献[10-16]。最终确定条件为：精密称取大果山楂干燥粉末约1 g，置于250 mL烧瓶内，加7 mol/L盐酸溶液50 mL，回流提取6 h，冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩至干燥，挥去HCl[16]，使溶液pH>3。用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，即得生药为100 g /L的样品溶液。微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm),室温；流动相为甲醇∶水(体积比为3∶97)，用冰醋酸调节pH至4.0，流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长：205 nm。

2.3 方法学考察2.3.1 系统精密度试验

分别用一定浓度的各氨基酸对照品溶液，按照“2.2色谱条件”重复进样6次，测得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸峰面积的RSD分别为1.6%、1.1%、0.1%和1.6%，结果表明系统精密度较好。

2.3.2 重复性试验

按照“2.1.2”项下内容操作，平行6份。以“2.2”中的色谱条件检测，测得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸含量的RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 系统适应性试验

按照“2.2”色谱条件，得到实验结果如下：供试品溶液中组氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的理论塔板数均≥2 600，分离度均>1.5，实验结果表明系统适用性良好，可用于检测。色谱图如图1和2所示。

图1 大果山楂对照品的色谱图

图2 大果山楂供试品的色谱图

2.3.4 线性范围考察

将“2.1.1”中配制好的各有机酸对照品储备液进行稀释，得到浓度如下的各溶液：酪氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；亮氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；苯丙氨酸溶液：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L；组氨酸：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。按照“2.2”项下色谱条件检测，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，得回归分析方程、相关系数以及线性范围，结果见表1。

表1 回归方程、线性范围和相关系数

2.3.5 回收率试验

称取6份已知各成分含量的大果山楂样品适量，分别精密加入适量的各氨基酸对照品，按照“2.1.2”中的方法操作，按照“2.2”中的色谱条件进行检测。各成分的加样回收率见表2。

表2 回收率结果(n=6)

2.4 样品含量测定

按照上述条件进行测定，以外标对照法计算，各种氨基酸的含量结果见表3。

表3 氨基酸的含量

3 讨论

目前，大多数文献报道氨基酸的提取采用超声醇提[12]、水提[12-13]和酸提[14-15,17]。按照朱福灼等用75%乙醇溶液冷凝回流提取2 h实验[12],结果出峰效果不好。参考许慧等对鹿茸药材中14种氨基酸的含量测定的研究[14]及苏雅拉图等人对蓖麻饼粕提取氨基酸及酸水解法优化初探的实验结果[15]，结合本产品特征和仪器性能建立了大果山楂中氨基酸的提取方法。然而据目前的文献报道，山楂中的酪氨酸含量大于亮氨酸的含量[9-10]，本实验所得结果与之相反。是否由于提取方法不同，或是生长环境和品种不同所致，尚待进一步研究。

4 结论

本实验建立了大果山楂中氨基酸提取方法：采用7 mol/L盐酸冷凝回流6 h提取大果山楂中的氨基酸；采用灵敏度和准确度较好的高效液相色谱法测定了大果山楂中氨基酸的含量。研究结果表明，色谱条件简单易行，仪器精密度和回收率高，重现性好，表明此实验方法可行。