秀珍菇染料脱色过氧化物酶基因的克隆及表达分析*

王伟科，陆 娜，林佳瑶，陈观平

（1.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310000；2.浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310012）

碳源是食用菌生长发育最重要的营养和能量来源，而碳源最主要的来源是木质纤维素[1]。由于木质素分子量较大且有致密的结构，因此需要由菌丝体分泌的胞外酶将其解聚成小分子化合物后才能被其消化吸收[2]。秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 等白腐真菌可分泌丰富的胞外氧化酶用于降解木质素，这些细胞外氧化酶含有血红素，包括木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、染料脱色过氧化物酶（dyedecolorizing peroxidase, DyP） 等。

染料脱色过氧化物酶属于血红素过氧化物酶超家族中新的一类，其广泛存在于真菌和细菌中[3]，在各种生物环境中发挥作用，包括细胞外环境和细胞膜内环境，其除了具有过氧化物酶功能外还具有诸多生物活性，如水解酶及氧化酶活性[4]，但其在食用菌中的功能还未见报道。通过利用RNA-seq 技术对秀珍菇转录组进行了测序，并根据数据拼接结果克隆了染料脱色过氧化物酶基因，同时对基因进行同源分析并构建系统发育树，检测了其在秀珍菇低温胁迫下的表达情况，探究基因在秀珍菇生长发育过程中的作用，为秀珍菇分子育种及高效栽培技术研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

秀珍菇“杭秀2 号”由杭州市农业科学研究院提供。培养基配方为棉籽壳39%、木屑39%、麸皮18%、石膏1%、石灰1%。菌包接种后于26～28 ℃条件下避光培养，待菌丝满袋后，选取生长状态一致的菌包开展试验。挑取发菌良好的菌包料面菌丝体10 g，室温26 ℃，记为S0；发菌良好的菌包置于10 ℃条件下12 h，取样，记为S1。每样3 个重复，所有样本置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 仪器与试剂

LightCycler 480 PCR 仪，美国罗氏（Roche） 公司；GelDoc XR+凝胶成像仪，美国伯乐生物科技有限（Bio-Rad） 公司；DYCP-31DN 核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司；TRizol Reagent Trizol，美国英杰生命技术有限（Invitrogen） 公司；pMD18-T T 载体，日本Takara 公司；DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA 的提取

秀珍菇总RNA 的提取采用Trizol 法[5]，样本在液氮中研磨后加入Trizol，离心后在上清液中加入100 μL 氯仿和异戊醇（24 ∶1，V/V），振荡混匀，离心。取上清加入400 μL 异丙醇沉淀RNA。离心弃上清，沉淀经75%乙醇洗涤后溶于50 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC） 处理水中。

1.3.2 cDNA 的合成

总RNA 经1.2%琼脂糖凝胶电泳及核酸分析仪检测纯度和浓度后，在无RNAase 污染的PCR 管中加入1 μL Oligo（dT）、1 μL total RNA、1 μL dNTP、12 μL DEPC 水，70 ℃保持10 min 后，冰浴。然后后加入2 μL 5× first strand Buffer，2 μL 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），42 ℃反应2 min，加入1 μL莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒（moloney murine leukemia retrovirus，MMLV），42 ℃孵育50 min。

1.3.3 基因克隆

根据RNAseq 测序结果，选取秀珍菇染料脱色过氧化物酶基因（命名为PpDypA） 相关表达序列（以ATG 为起始密码子、TGA 为终止密码子的最长编码序列），利用Vector NTI Advance 11.5 软件拼接成完整基因。同时运用引物设计软件Primer 5.0 设计相关引物（PpDypA-F：ATGTCTACACCTGCACCAACT；PpDypA-R：TCAAGTGGAAATCGGGGCCTG）。以反转录后的cDNA 为模板进行PCR 扩增。50 μL 反应体系包含10× Buffer 5 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，10 mM 的PpDypA-F 以及PpDypA-R 各4 μL，cDNA 模板2 μL，5 U·μL-1的高保真DNA 聚合酶（AccuPrime Pfx DNA Polymerase） 0.5 μL，ddH2O 30.5 μL。扩增程序为93 ℃预变性3 min；93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，28 个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳后，用DNA 胶回收试剂盒纯化回收。连入T 载体，转化大肠杆菌菌株DH5α，酶切检测后的阳性克隆送杭州擎科生物技术有限公司测序。

1.3.4 基因及其编码蛋白的生物信息学分析

生物信息学分析主要采用BLAST、amigo、UniProt、PSIPRED、AlphaFold等网上软件包进行[6-10]。使用Vector NTI Advance 11.5、DNAstar 软件对序列进行多重比对、分析，并用MEGA X 软件构建进化树。

1.3.5 秀珍菇菌丝体低温处理后PpDypA 基因表达分析

分别提取秀珍菇菌丝体常温状态（S0） 样本及低温处理12 h 后（S1） 样本的总RNA，并按照iScript cDNA Synthesis Kit 进行cDNA 第一链的合成，根据测序成功的PpDypA 基因序列设计出特异性qRT-PCR 引物，见表1。

表1 qRT-PCR 反应引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

参照SYBR Premix Ex TaqTM II 使用说明，用qRT-PCR 的方法检测PpDypA 基因在秀珍菇菌丝体经不同处理后的表达情况，以Actin 为内参基因，2-ΔΔCt法计算该基因的相对表达量[11]。

2 结果与分析

2.1 PpDypA 序列的获得及序列分析

利用RT-PCR 技术从秀珍菇中得到约1 500 bp的DNA 片段，克隆至PMD18-T 载体后测序，将测序结果与GenBank 中登录的基因进行同源性比较和功能预测分析，共获得1 515 bp 的全长序列，命名为PpDypA。BLAST 显示其与染料脱色过氧化物酶基因（GenBank：UEC49157.1） 相似度为97.22%，表明所获基因编码蛋白属于染料脱色过氧化物酶家族。PpDypA 基因的ORF 读码框及翻译结果见图1。

如图1 所示，通过ORF Finder 寻找得到PpDypA 的开放读码框，推断其为可编码504 个氨基酸的功能蛋白。

应用Vector NTI 软件推算该蛋白的相对分子质量约54.8 kDa，等电点pI 为6.35。GenBank 工具预测显示该蛋白质含有1 个保守的DyP 过氧化物酶超家族结构域，见图2。

图2 秀珍菇PpDypA 基因编码氨基酸序列的保守区域Fig.2 Characteristic conserved domain of amino acid sequence encoded by PpDypA gene

由图2 可知，该蛋白的第92～483 个氨基酸的序列区域为保守结构域，进一步说明所获基因编码蛋白属于DyP 家族。

2.2 PpDypA 基因编码蛋白的高级结构分析

利用PSIPRED[9]和AlphaFold[10]对PpDypA 基因编码蛋白进行预测和分析，结果见图3～图4。

图3 秀珍菇PpDypA 基因编码氨基酸序列的二级结构预测Fig.3 Predicted secondary structure of amino acid sequence encoded by PpDypA gene

图4 PpDypA 基因编码蛋白的三维建模Fig.4 Predicted three dimensional protein structures encoded by PpDypA gene

由图3、图4 分析发现，该蛋白存在螺旋-卷曲（Helix-Coil） 结构，三级结构预测该蛋白可能存在催化结合口袋，预示该蛋白可能存在催化活性。

2.3 PpDypA 基因编码蛋白的氨基酸序列分析

DypA 具有比较保守的结构域，用DNAstar 对黄白侧耳（Pleurotus cornucopiae，KAG9225391.1），杏鲍菇（Pleurotus eryngii，KAF9496869.1），糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus，XP_036625896.1），紫孢侧耳（Pleurotus sapidus，UEC49157.1） 的氨基酸序列进行多序列比对，结果见图5。可见，DypA 家族结构域高度保守，具有很高的同源性。

图5 5 种食用真菌DypA 蛋白序列比对Fig.5 Comparison of amino acid sequence of DypA in 5 edible fungi

2.4 PpDypA 氨基酸序列系统进化分析

利用MEGA X 软件对糙皮侧耳（XP_036625896.1）、杏鲍菇（KAF9496869.1）、黄白侧耳（KAG9225391.1）、紫孢侧耳（UEC49157.1）、奥氏蜜环菌（Armillaria solidipes，PBK60244.1）、高卢蜜环菌（Armillaria gallica，PBK80505.1）、草菇（Volvariella volvacea，AKU 04643.1）、黏小奥德蘑（Mucidula mucida，KAF 8900000.1）、隆纹黑蛋巢菌（Cyathus striatus，KAF 9002157.1）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus，RDB 22012.1）、紫丁香蘑（Lepista nuda，KAF9466754.1）、纯白小口蘑（Tricholomella constricta，KAF5375843.1）、平田头菇（Agrocybe pediades，KAF9558529.1）、古巴裸盖菇（Psilocybe cubensis，KAH9475054.1）、松茸（Tricholoma matsutake，KAF8233757.1）、秀珍菇（Pleurotus pulmonarius，KAF4582714.1） 的食用菌DypA 同源蛋白进行分子系统进化分析，氨基酸序列系统进化树见图6。如图6 所示，秀珍菇DypA 蛋白与紫孢侧耳、黄白侧耳、糙皮侧耳等整体亲缘关系比较接近，聚为一簇。同时，与其他食用真菌DypA蛋白也具有较高的相似度，说明DypA 蛋白在序列进化上相对保守。

图6 DypA 氨基酸序列系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of DypA

2.5 PpDypA 编码蛋白的GO 功能分析

GO 功能分析显示，秀珍菇DypA 蛋白属于DyP型过氧化物酶家族，其主要参与果糖、岩藻糖、甘露糖等代谢过程，有应答氧化胁迫的功能，并具氧化还原活性。

2.6 秀珍菇菌丝体低温处理后PpDypA 的表达研究

对比秀珍菇菌丝体常温、低温2 种状态下PpDypA 基因的表达情况结果见图7。由图7 可知，低温处理后PpDypA 的表达量明显高于常温状态，说明PpDypA 的表达受低温诱导，可能在低温诱导后开启高表达模式，从而更好的让菌丝体分解木质素，为出菇做准备。

图7 秀珍菇低温处理后PpDypA 基因的表达情况Fig.7 Expression profile of PpDypA gene in low temperature

3 结论与讨论

通过研究秀珍菇染料脱色过氧化物酶基因的克隆及表达情况，发现该基因全长为1 515 bp，编码504 个氨基酸，其蛋白相对分子质量约54.8 kDa。氨基酸序列系统进化分析结果表明，DypA 家族具有很高的同源性。经实时荧光定量PCR 检测，在秀珍菇中该基因经过低温处理后的表达量显著上升。

食用菌在营养生长过程中，对于复杂的有机物，如纤维素、木质素等往往不能直接转化成碳源利用，需要分解后才能吸收[12]。食用菌胞外酶可将坚硬且复杂的有机物分解为简单的单糖，供自身利用[13]。DyP 型过氧化物酶可能会参与木质纤维素降解，特别是缺乏原型木质素分解II 类过氧化物酶的真菌[14]。秀珍菇原基形成往往需低温刺激，一般认为，原基的形成是菌丝体在适宜的温度、湿度、空气环境条件下的扭结，完成食用菌菌丝体由营养生长向生殖生长的转变，这一过程往往需要大量的能量代谢。DyP 型过氧化物酶在该过程中的大量表达可能明显地促进了菌丝体对木质素的降解，从而让其获取更多的能量。已有研究表明，DyP 型过氧化物酶可催化木质素类化合物的氧化，其在生物降解木质素、造纸、食品加工、净化土壤、染料脱色等方面具有普遍的应用价值[15]。将来，重组表达技术的进步将促进和改善DyP 型过氧化物酶的利用，DyP 在木质素降解和酚类环境污染物修复方面必将发挥巨大的生物潜力。