例析高考试题中的现代生物技术

甘耀平

(浙江省衢州第二中学)

《普通高中生物学课程标准(2017年版2020年修订)》(以下简称“课程标准”)提出注重科学、技术和社会相互关系是贯穿生物学教学的重要主线之一,也是生物学学科核心素养达成的重要途径,教师应该重视渗透科学、技术、社会相互关系的教育[1]。以生物技术为背景材料的试题是近几年高考命题的热点,受到高考命题专家的青睐。这类试题把课本知识和生物技术有机结合,情境新颖而不陌生,考查灵活而不偏颇,能很好地考查学生信息获取和知识迁移应用等关键能力。同时试题体现了较强的时代性、应用性和创新性,指向不同水平核心素养的评价目标。

1.凝胶色谱法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

例1.(2023年全国甲卷37题节选)为了研究蛋白质的结构与功能,常需要从生物材料中分离纯化蛋白质。某同学用凝胶色谱法从某种生物材料中分离纯化得到了甲、乙、丙3种蛋白质,并对纯化得到的3种蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果如图1所示(“+” “-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知甲的相对分子质量是乙的2倍,且甲、乙均由一条肽链组成。回答下列问题。

(1)图中甲、乙、丙在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时,迁移的方向是____________(填“从上向下”或“从下向上”)。

图1

(2)图中丙在凝胶电泳时出现2个条带,其原因是_______________。

(3)凝胶色谱法可以根据蛋白质________的差异来分离蛋白质。据图判断,甲、乙、丙3种蛋白质中最先从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是________,最后从凝胶色谱柱中洗脱出来的蛋白质是________。

参考答案：(1)从上向下 (2)丙由2种相对分子质量不同的肽链组成,在SDS的作用下解聚成2种肽链,2种肽链的电泳迁移率不同 (3)相对分子质量 丙 乙

解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法[2]。它是根据多孔介质对不同大小(体积)和不同形状的分子的排阻能力不同来分离蛋白质混合物的[3]。所用的凝胶珠(凝胶颗粒)其内部是多孔的网状结构,目前常用的凝胶有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。凝胶色谱法分离的原理是当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构,只能在凝胶外部移动,随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动,其移动距离较短,移动速度也较快,就最先流出柱外;比凝胶珠孔径小的分子则不同程度地出入凝胶珠内外。这样不同大小(或相对分子质量)的蛋白质分子由于所经过的路径不同而得以分离,大分子(或相对分子质量大)的蛋白质先被洗脱出来,小分子(或相对分子质量小)的蛋白质后被洗脱出来。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的电泳方式。SDS是一种变性剂,它能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键相互作用,能使蛋白质的多肽链处于展开状态[3]。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS以其烃链与各种蛋白质分子的侧链通过疏水作用结合成复合体,SDS所带的负电荷量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,同时SDS使蛋白质都呈同样的棒状形态。因此SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎是完全根据蛋白质相对分子质量分离蛋白质的,蛋白质相对分子质量越小,迁移越快。

2.荧光蛋白标记技术

例2.(2023年全国乙卷38题节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。

(3)科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是_________(答出1点即可)。

(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是______________。

参考答案：(3)GFP基因虽然发生了突变,但由于存在密码的简并现象,突变基因所编码的氨基酸序列并未改变 (4)将YFP基因插入表达载体,再将构建成功的重组载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中,观察黄色荧光是否出现

解析：荧光蛋白标记是指利用不同颜色荧光质粒通过某种方式结合其他生物,最终携带有颜色荧光且不影响生物正常生理生长的一种方法。因其高灵敏度备受研究者关注,成为目前生物大分子检测的主要方法[4]。

荧光蛋白主要包括绿色、黄色和红色3种,绿色荧光蛋白(GFP)是最早从水母分离得到的发光蛋白,由238个氨基酸组成,可在多种生物中广谱表达而发出绿色荧光。下村修、马丁·查尔菲和钱永健三位科学家因首次发现绿色荧光蛋白并在其应用上做出了突出贡献而获得了2008年诺贝尔化学奖。黄色荧光蛋白(YFP)最初来自维多利亚多管水母,是GFP的突变体,其第203位由苏氨酸变为酪氨酸。红色荧光蛋白(RFP)最初从珊瑚虫中分离,是GFP的同源荧光蛋白。荧光蛋白标记技术可充分利用不同颜色的荧光稳定性特点,能快速标记且检测简单,能稳定遗传且有最佳的示踪结果[4]。

3.放射自显影技术

例3.(2023年1月浙江省选考第23题节选)研究光合产物从源分配到库时,给叶片供应13CO2,13CO2先与叶绿体内的________结合而被固定,形成的产物还原为糖需接受光反应合成的________中的化学能。合成的糖分子运输到果实等库中。在本实验中,选用13CO2的原因有_________(答出2点即可)。

参考答案：五碳糖(C5) ATP和NADPH CO2是光合作用的原料;13C可被仪器检测;13C在自然界中含量极少且稳定

解析：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用,对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪是这一技术独具的特征[5]。常用于生物学研究的同位素及其性质如表1所示,根据实验要求可选择合适的同位素。

表1 常用放射性同位素的基本特性[5][6]

科学史上,研究DNA是遗传物质时,选用32P标记噬菌体的DNA;研究DNA复制时选用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR);研究RNA合成时选用3H标记的尿嘧啶核苷(3H-U);研究蛋白质合成和代谢时,选用35S标记的甲硫氨酸(蛋氨酸)、3H或14C标记的亮氨酸等;卡尔文研究光合作用时,选用14C标记的CO2;研究甲状腺的功能时,选用131I标记的NaI。

4.miRNA和siRNA介导的RNA干扰技术

例4.(2023年广东卷17题节选)放射性心脏损伤是由电离辐射诱导的大量心肌细胞凋亡产生的心脏疾病。一项新的研究表明,circRNA可以通过miRNA调控P基因表达进而影响细胞凋亡,调控机制见图2。miRNA是细胞内一种单链小分子RNA,可与mRNA靶向结合并使其降解。circRNA是细胞内一种闭合环状RNA,可靶向结合miRNA使其不能与mRNA结合,从而提高mRNA的翻译水平。

图2

回答下列问题:

(2)前体mRNA是通过________酶以DNA的一条链为模板合成的,可被剪切成circRNA等多种RNA。circRNA和mRNA在细胞质中通过对________的竞争性结合,调节基因表达。

(3)据图分析,miRNA表达量升高可影响细胞凋亡,其可能的原因是_______________。

参考答案：(2)RNA聚合 miRNA (3)miRNA表达量升高会阻断P基因的mRNA合成P蛋白,降低P蛋白对细胞凋亡的抑制作用,促进细胞凋亡

例5.(2023年湖南卷7题)基因Bax和Bcl-2分别促进和抑制细胞凋亡。研究人员利用siRNA干扰技术降低TRPM7基因表达,研究其对细胞凋亡的影响,结果如图3所示。下列叙述错误的是

( )

图3

A.细胞衰老和细胞凋亡都受遗传信息的调控

B.TRPM7基因可能通过抑制Bax基因的表达来抑制细胞凋亡

C.TRPM7基因可能通过促进Bcl-2基因的表达来抑制细胞凋亡

D.可通过特异性促进癌细胞中TRPM7基因的表达来治疗相关癌症

参考答案：D

解析：RNA干扰(RNAi)是指通过形成特定双链RNA使目标mRNA发生降解或者翻译受到阻遏,从而特异性地抑制目标基因在翻译水平上表达的现象[7]。RNA干扰有两种类型,即miRNA和siRNA。这两类干扰RNA来源不同,作用机制和作用效果基本相同:成熟的形式都是短的双链RNA;在发挥作用时,与蛋白质结合形成沉默复合物;在ATP供能的作用下,双链RNA解开,并促使其与mRNA配对,结果使mRNA降解或使其翻译受阻。

表2 miRNA和siRNA的比较

5.逆转录PCR技术和原位杂交技术

例6.(2022年1月浙江选考第29题节选)我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。

(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链RNA为模板,利用____________酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的____________,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。

参考答案：逆转录 核酸探针

解析：逆转录PCR技术(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种变式应用,其基本原理是在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成cDNA,然后利用DNA聚合酶,以cDNA为模板合成双链DNA,再用常规PCR技术扩增出大量DNA[8](具体过程如图4所示)。

图4 逆转录PCR过程示意图

逆转录PCR技术可用于获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统等,还可以用来分析不同组织细胞或是相同组织细胞在不同发育阶段中mRNA的表达情况。

原位杂交技术是细胞内特异核酸(DNA或RNA)定性与定位的重要方法,其原理是利用报告分子(如荧光素、生物素等)标记核酸探针,然后将探针与染色体或DNA显微切片上的靶DNA杂交,若两者同源互补,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。原位杂交技术在显微与亚显微水平上基因定位、特异mRNA表达等问题的研究中具有重要作用[5]。

6.CRISPR/Cas9基因编辑技术

例7.(2021年6月浙江省选考第20题)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入到受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是

( )

A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液

B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠

C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠

D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎

参考答案：B

解析：CRISPR/Cas9基因编辑技术是继“锌指核酸酶(ZFN)” “类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的新一代基因组定点编辑技术,自发现之后迅速发展成为当今最主流的基因编辑方法[9]。

图5 CRISPR/Cas9系统的功能(根据参考文献[9]修改)