LBD12转录因子调控毛果杨木材形成研究

高 源,孙佳彤,周晨光,姜立泉,李 伟,李 爽*

(1.林木遗传育种全国重点实验室(东北林业大学),黑龙江 哈尔滨 150040;2.辽宁省森林经营研究所,辽宁 丹东 118000)

木材是重要的工业生产原料,是制浆造纸、房屋建造以及家具制造的关键原材料。因此,对木材的研究以及获取具有优良木材的良种刻不容缓。木材的形成是一个连续且复杂的过程,包括维管形成层分裂分化、次生细胞壁加厚、细胞壁木质化、细胞程序化死亡,最后形成木材[1-2]。

转录因子(transcription factor, TF),是调节植物生长发育的特殊结构蛋白,在植物生长过程中的各个生物进程均发挥重要的调控作用[3-5]。木材的形成离不开转录因子的精确调控,不同转录因子之间相互作用构成木材形成过程中复杂的转录调控网络[6-15]。已有研究报道,一些转录因子家族在次生细胞壁形成的过程中起关键的调控作用,如NAC、MYB、WRKY、bHLH、LBD转录因子家族等[16-21]。毛果杨(Populustrichocarpa)NAC家族PtrSND1转录因子可直接调控MYB家族转录因子PtrMYB074,进而影响木材的形成[6, 8]。最新的研究结果表明,PtrMYB074转录因子可以与PtrWRKY19转录因子互作,并被其招募到下游PtrbHLH186启动子上,促进PtrbHLH186的表达[21]。在毛果杨中PtrbHLH186基因过表达后,植株出现木材形成异常,具体表现为植株生长迟缓、木质部导管细胞小而多、木质化程度提高、木质素含量增加等[21]。以上结果表明,毛果杨PtrbHLH186转录因子作为木材形成NAC、MYB家族转录因子的下游因子,在木材形成过程中同样发挥着重要的调控作用,是木材形成的关键调控因子之一,但是其调控的下游基因及其生物功能研究尚不明确。

LBD(lateral organ boundaries domain)是植物特有的转录因子家族,具有高度保守的LOB(lateral organ domain)结构域[22]。有研究表明,在调控木质部分化关键调节因子NAC-Domain7(VND7)介导的木材形成途径中,也有该家族转录因子AtLBD30的参与[23]。毛白杨(P.tomentosa)中,PtaLBD1过量表达使转基因植株次生韧皮部增厚;此外,PtaLBD4在次生韧皮部特异表达,PtaLBD15、PtaLBD18在次生木质部特异表达[24]。说明毛白杨LBD家族转录因子参与木材形成的调控过程。毛果杨中,PtrLBD39在应拉木中转录水平最高,PtrLBD39及其同源基因PtrLBD22功能缺失突变体的应拉木形成区域明显减少,木质素的含量增多且纤维素含量减少,表明PtrLBD39和PtrLBD22是应拉木形成的关键调节因子[25]。目前,在多种植物尤其是拟南芥(Arabidopsisthaliana)中都有关于LBD转录因子的研究,但仍有大量LBD的功能是未知的[26]。

东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室研究团队前期获得了木材形成关键调控基因PtrbHLH186的过表达植株,收集其木质部材料进行了RNA-seq和ChIP-seq分析,筛选出了PtrbHLH186调控的下游转录因子PtrLBD12。但PtrLBD12是否参与木材形成的调控过程以及在木材形成过程中的生物学功能尚不清楚。因此,本研究创制了毛果杨PtrLBD12过表达植株,对其生长及木材形成特征进行了观察分析,初步揭示该基因在木材形成过程中的功能。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室保存的毛果杨植株,基因型为Nisqually-1。用次氯酸钠对野生型毛果杨侧枝进行消毒,经植物组织培养进行芽诱导,获得无菌毛果杨组培苗[27]。组织培养条件:温度25 ℃,光强约40 μmol/(m2·s),光周期为16 h光照/8 h黑暗。温室培养条件:温度范围22～25 ℃,光量子强度约300 μmol/(m2·s),光周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 毛果杨PtrLBD12基因的克隆与分析

毛果杨PtrLBD12基因的克隆。利用PtrLBD12基因序列号在毛果杨基因组网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中获取该基因完整的序列信息。设计该基因特异性引物(表1),利用PCR扩增目的片段并连接到pENTR/TOPO载体上,测序验证PtrLBD12序列。

表1 所用引物及序列

毛果杨PtrLBD12基因特异性表达分析。用于基因组织特异性表达分析的数据来源于Yeh等[15]发表的数据信息。

1.3 毛果杨PtrLBD12瞬时表达载体构建及亚细胞定位

毛果杨PtrLBD12基因瞬时表达载体的构建。以pENTR/TOPO-PtrLBD12质粒为模板,进行目的片段的扩增和回收。利用XbaI和XhoI酶切目的基因和pUC19-35S-GFP瞬时表达载体,37 ℃水浴2 h。通过凝胶电泳验证酶切产物正确后,回收进行T4连接,转化大肠杆菌并测序。获得的载体利用氯化铯-溴化乙锭超高速梯度密度离心法提取质粒。

亚细胞定位。本研究毛果杨木质部原生质体的酶解和转化方法参照Lin等[28]建立的原生质体瞬时转化体系。取4段8～9 cm毛果杨野生型茎段,扒皮后放入酶解液中室温静置酶解3 h。通过MMG溶液(0.5 mol/L甘露醇,4 mmol/L MES, 15 mmol/L氯化镁)释放并收集原生质体,稀释至2×105个细胞/mL。以1∶10∶11(体积比)比例依次加入pUC19-35S-PtrLBD12-GFP质粒及细胞核定位质粒pUC19-35S-H2A-mCherry、原生质体、聚乙二醇(PEG)溶液,混匀后静置10 min。终止反应后重悬,移入细胞培养板避光过夜培养,利用激光共聚焦显微镜观察结果。

1.4 毛果杨PtrLBD12基因过表达植株创制

毛果杨PtrLBD12基因过表达载体构建。带有BamHI和SacI酶切位点的PtrLBD12CDS序列构建到35S启动子介导的植物表达载体pBI121上,特异性引物序列见表1,方法同上述载体构建方法。利用35S-F引物和pBI121-LBD12-R引物进行检测并测序(表1),即得pBI121-35S-PtrLBD12载体。

通过农杆菌介导的毛果杨遗传转化创制PtrLBD12过量表达转基因植株。将测序正确的pBI121-35S-PtrLBD12质粒转入农杆菌感受态GV3101中。选用35S-F和基因R端引物进行单克隆的检测,挑取检测正确克隆摇菌保存。毛果杨的遗传转化过程参照已经建立的方法[8, 21, 27]。

DNA水平鉴定毛果杨PtrLBD12过表达植株。以抗性植株叶片DNA为模板,分别以载体pBI121引物35S-F及PtrLBD12基因R端引物进行PCR扩增,选择毛果杨野生型植株DNA、水和pBI121-35S-PtrLBD12质粒作为对照进行凝胶电泳分析。

RNA水平鉴定毛果杨PtrLBD12过表达植株。收集转基因和野生型植株木质部,提取RNA并反转录,以毛果杨PtrActin7基因作为内参,定量PCR分析PtrLBD12在转基因植株中的表达水平。

1.5 毛果杨PtrLBD12转录因子的功能分析

PtrLBD12过表达毛果杨植株生长指标的测定。将组培瓶中生长至5～8 cm高的OE-PtrLBD12-L1转基因植株和同龄的野生型毛果杨植株移栽到温室中,观察PtrLBD12转基因植株的表型。对生长30、60、90 d的野生型以及PtrLBD12转基因植株进行拍照,测定12株野生型及PtrLBD12转基因植株的生长指标,包括树高、地径、茎节数以及第8茎节长度,共3次生物学重复,通过SPSS统计分析PtrLBD12转基因植株的生长指标。

通过石蜡切片观察PtrLBD12过表达植株茎干细胞。选取同龄转基因及野生型温室植株第2、4、6、8茎节的中间区域,将每个茎段切成厚度为0.8～1.0 cm小段,放入预冷的固定液西林瓶中。置于冰上真空固定,并进行脱水、透明、浸蜡,浸蜡后包埋茎段并切片,利用番红、固绿和甲苯胺蓝水溶液染色,染色后用树脂封片,使用软件莱卡LAS V4.8和LAS X V2.0对组织染色后的石蜡切片横切面进行图像采集并统计分析,随机取3个野生型和转基因植株的第8茎节的横切面,每个横切面随机选3个等比例的区域,统计单位面积(mm2)导管、纤维细胞的数量及导管细胞平均孔径大小(μm2)。

木质素单体合成酶基因表达水平分析。提取培养4个月的毛果杨野生型及PtrLBD12过表达植株的木质部总RNA,反转录成cDNA,设计木质素单体合成酶基因的特异性定量引物(表2),通过定量PCR及2△△Ct计算法分析PtrLBD12基因的过表达植株中木质素单体合成酶基因的表达情况。

表2 木质素单体合成酶基因定量引物序列

2 结果与分析

2.1 PtrLBD12基因的获得

前期研究中获得了毛果杨木材形成关键调控基因PtrbHLH186过表达植株的木质部组织RNA-seq以及ChIP-seq数据,通过对RNA-seq以及ChIP-seq数据的整合分析,筛选出了PtrbHLH186结合并调控的下游转录因子PtrLBD12。

利用毛果杨木质部、韧皮部、顶芽和叶片不同组织对PtrLBD12基因的表达模式进行分析,结果显示PtrLBD12基因在木质部和韧皮部中表达明显高于其他组织(图1)。推测PtrLBD12转录因子在木质部和韧皮部中发挥一定的调控作用,参与木材形成过程的调控。为了进一步分析其功能,本研究通过基因克隆和测序验证,获得了PtrLBD12基因894 bp的CDS序列。

误差线代表3个生物学重复的SE值。Error bars represent SE values of three independent experiments. *.P<0.05. 图1 PtrLBD12基因在毛果杨4种组织中的表达水平Fig. 1 The transcript abundance of PtrLBD12 in four tissues of Populus trichocarpa

2.2 毛果杨PtrLBD12的亚细胞定位

为了进一步揭示PtrLBD12蛋白的表达特征,将PtrLBD12融合绿色荧光蛋白(GFP)构建到由组成型启动子35S驱动的瞬时表达载体pUC19上,获得pUC19-35S-PtrLBD12-GFP载体。选用融合樱桃红荧光蛋白(mCherry)的组蛋白H2A作为细胞核定位标记蛋白。提取质粒后,通过PEG介导的毛果杨木质部原生质体瞬时转化法[28],将pUC19-35S-PtrLBD12-GFP和pUC19-35S-H2A-mCherry共同转入原生质体中。结果显示,代表PtrLBD12蛋白的绿色荧光信号与组蛋白H2A-mCherry红色荧光信号完全重合。说明毛果杨PtrLBD12转录因子在细胞核中表达,具有转录因子的一般特征(图2)。

图2 毛果杨PtrLBD12亚细胞定位Fig. 2 Subcellular localization of PtrLBD12 in P. trichocarpa

2.3 毛果杨PtrLBD12过表达植株的创制

毛果杨PtrLBD12过表达植株见图3。其过程为将PtrLBD12基因的CDS序列连接到35S启动子介导的pBI121植物表达载体中,成功获得植物表达载体pBI121-35S-PtrLBD12。将pBI121-35S-PtrLBD12载体转入农杆菌感受态GV3101中,通过农杆菌介导的毛果杨遗传转化方法创制转基因植株。将侵染并共培养后的外植体使用头孢霉素溶液和清水清洗脱去农杆菌(图3a),置于含抗生素的选择培养基上培养1个月左右诱导抗性芽的发生(图3b),将茎段两端生长出的抗性芽放入抗性生根培养基进行初步筛选。将可在抗性培养基中生根的抗性芽再次移入新的抗性生根培养基中,2次生根后进行后续的DNA和RNA水平鉴定(图3c)。提取抗性植株叶片的DNA,以载体引物35S-F和PtrLBD12的R端引物PCR扩增,凝胶电泳检测。结果表明以抗性植株叶片DNA为模板的样品扩增出与pBI121-35S-PtrLBD12质粒为模板大小一致的目的条带,而以水及野生型叶片为模板的阴性对照泳道无条带,表明PtrLBD12基因已成功整合到抗性植株的基因组中(图3d)。分别收集转基因和野生型毛果杨温室植株的木质部,提取总RNA并反转录获得cDNA,通过相对定量在转录水平上分析PtrLBD12基因在转基因植株中的表达水平。与野生型相比,OE-PtrLBD12-L1的相对表达量为40.91,L2为79.51,L3为102.19,表明这些转基因植株中PtrLBD12基因的表达水平均明显上调(图3e)。

a.愈伤组织分化诱导callus induction;b. 抗性芽诱导shoot induction;c. 抗性植株筛选the screening of the kanamycin-resistant plants;d. 转基因植株的PCR鉴定identification of transgenic plants by PCR(M. DNA marker DL2000;1. ddH2O为模板的阴性对照 negative control with ddH2O as PCR template;2. PBI121-35S-PtrLBD12质粒为模板的阳性对照positive control with plasmid PBI121-35S-PtrLBD12 as PCR template;3. 野生型毛果杨叶片DNA为模板的阴性对照negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template;4—6. 抗性植株叶片DNA为模板的样品sample with leaf DNA of kanamycin-resistant plant as PCR template);e. 过量表达植株中PtrLBD12基因的相对表达水平relative expression levels of PtrLBD12 gene in overexpression plants。*.P<0.05,**.P<0.01。下同。The same below.图3 毛果杨转基因植株的获得Fig. 3 Generation of P. trichocarpa transgenic plant

2.4 毛果杨PtrLBD12转录因子的功能分析

为了初步了解PtrLBD12转录因子的生物学功能,对已获得的过表达PtrLBD12-L1植株和野生型对照同时移栽到温室中,观察其生长情况。对生长至30、60、90 d的植株生长指标进行测定。与野生型毛果杨相比,PtrLBD12过表达植株高度较矮(图4a、4b),植株地径、茎节数、第8茎节长度均明显降低(图4b)。说明PtrLBD12基因过表达影响了毛果杨的正常生长发育。

a. 生长30、60、90 d的毛果杨野生型与PtrLBD12过表达植株的表型观察 phenotypic observations of P. trichocarpa wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at 30, 60 and 90 days;b. 不同生长时期的毛果杨野生型与过表达PtrLBD12植株的生长指标测定 growth indicators determination of wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at different growth periods。图4 毛果杨野生型和过量表达植株生长表型分析Fig. 4 Growth phenotype analysis of P. trichocarpa wild-type and OE-PtrLBD12 plants

为了进一步分析PtrLBD12转录因子是否影响木材形成过程,对温室培养4个月的过表达和野生型植株的第2、4、6、8茎节进行石蜡切片,利用番红固绿对染法对茎干横切面进行染色观察(图5a)。木质部细胞壁中的木质素在番红染料的染色下呈现紫红色,纤维素在固绿染料的染色下呈现蓝绿色,且染色深浅与木质素、纤维素含量成正相关。切片分析发现,毛果杨中PtrLBD12过表达后,第2茎节开始出现少量的导管细胞,未分化出纤维细胞,而野生型植株的第2茎节并未出现导管和纤维细胞;转基因植株第4茎节分化出4～5层均匀排列的导管细胞,而野生型则刚开始分化出1～2层导管细胞;转基因植株第6茎节出现明显的纤维细胞,而野生型仅有少量纤维细胞出现,且转基因植株紫红色的木质化区域明显宽于野生型,PtrLBD12过表达植株茎干木质化程度增强;转基因植株第8茎节导管细胞和纤维细胞均发育完全,与野生型无明显差异。通过对染料着色程度的对比观察发现,转基因植株第6和8茎节中红色着色明显比野生型植株深,说明PtrLBD12过表达后木质素沉积被增强。

a. 培养4个月的毛果杨野生型(WT)与(OE-PtrLBD12-L1)过表达植株番红固绿染色(红色线条代表木质部宽度,比例尺为100 μm) stem cross sections and magnified images of 4-month old OE-PtrLBD12-L1 and wild-type plants (The cross sections were stained with safranin O and fast green, the red lines represent the width of the xylem, bar is 100 μm);b. 野生型(WT)和过表达(OE-PtrLBD12-L1)毛果杨各茎节形成层细胞形态观察(比例尺为50 μm) morphological observation of cambium cells in WT and OE-PtrLBD12-L1(Bar is 50 μm);c. 野生型和过表达植株导管和纤维细胞数量统计(黑色点所示部分为导管细胞,比例尺为50 μm) statistics on the number of vessel and fiber cells in wild and overexpressed plants (The part shown in the black dots are vessel cells, bar is 50 μm);d. 单位面积细胞数目统计 statistics analysis of cell number in per unit area;e. 导管孔径大小统计 statistics analysis of vessel lumen area。图5 毛果杨野生型与OE-PtrLBD12过表达植株组织切片表型观察Fig. 5 Paraffin section observation of WT and OE-PtrLBD 12plants

为了方便清晰地观察转基因植株形成层及木质部细胞形态结构,用甲苯胺蓝水溶液对OE-PtrLBD1过表达和野生型植株的第2、4、6、8茎节进行染色,观察各茎节形成层细胞状态(图5b)。结果显示,PtrLBD12过表达植株的形成层细胞的形态结构与野生型植株并没有显著变化。进一步对茎干横截面单位面积内导管细胞和纤维细胞数量、单个导管细胞的孔径大小进行了统计分析(图5c),结果显示,过表达植株茎干横切面单位面积内导管和纤维细胞数量显著增加(图5d),导管孔径明显减小(图5e)。这个结果表明,PtrLBD12基因的过表达影响了木质部中导管和纤维细胞的数量及导管细胞孔径的大小。

由于木材形成过程中,木质素沉积的早晚及强弱直接影响木质部细胞的形态结构,且根据切片结果得知,PtrLBD12基因的过量表达造成了木质部细胞木质素沉积模式发生改变。而毛果杨木质素的生物合成依赖于22个木质素单体合成相关酶基因的表达[29]。因此,本研究利用RT-qPCR检测了PtrLBD12过表达植株木质部中22个木质素单体合成酶基因的相对表达水平(图6)。结果显示,PtrLBD12过表达使植株木质部中PtrPAL1、PtrHCT6、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的表达水平显著或极显著升高,PtrC4H1、PtrC4H2、PtrCSE1基因的表达水平也有上调趋势。因此,PtrLBD12可以促进木质素合成酶基因的上调表达,增加植株木质素的沉积。

图6 PtrLBD12过表达植株中木质素单体合成酶基因的相对表达水平Fig. 6 The relative expression levels of monolignol genes in OE-PtrLBD12 plants

3 讨 论

木材是十分重要的工业原料,优良材性林木新品种的选育是保证木材供应的重要策略。木材的形成受到众多转录因子的调控,木材形成关键转录因子的鉴定及功能解析可为优良木材材性良种的创制提供重要的理论依据及候选基因资源。LBD转录因子家族在高等植物中广泛存在,它们在植物的生长发育、胁迫响应、次生生长等方面起着重要的作用。已有研究表明,LBD家族转录因子在木材形成方面发挥着广泛的调控作用。如白杨中的PtaLBD1和PtaLBD4调控次生韧皮部的发育,而PtaLBD15、PtaLBD18参与木质部的发育调控[24]。毛果杨中的PtrLBD39是应拉木形成的关键调节因子[25]。

毛果杨PtrLBD12基因是木材形成关键转录因子PtrbHLH186所结合并调控的下游基因。对其表达模式分析发现,该基因在毛果杨的木质部、韧皮部的表达水平显著高于在根、叶组织的表达水平,推测转录因子PtrLBD12可能参与木材形成的调控过程。为了探究PtrLBD12的生物功能,本研究构建了PtrLBD12的过量表达载体,并利用农杆菌介导的遗传转化法创制了过量表达植株。生长表型分析发现,PtrLBD12过表达导致毛果杨生长缓慢,株高、地径、茎节数等生长指标与野生型相比均表现出明显降低。结合组织切片和化学染色结果进一步分析,PtrLBD12过表达植株的木质素沉积水平增加,木质化程度增强。在形态结构方面,过表达植株茎干横截面的单位面积内,纤维细胞和导管细胞的数量显著增多,而导管的孔径减小,形成层细胞则没有明显变化。

木质素的沉积依赖于木质素单体合成酶基因的表达,毛果杨中木质素的生物合成由22个木质素单体合成酶基因控制[29]。PtrLBD12过表达植株中木质素单体合成酶基因PtrPAL1、PtrC4H1、PtrC4H2、PtrHCT6、PtrCSE1、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的转录水平被明显促进。因此,毛果杨PtrLBD12转录因子可以通过调节木质素合成酶相关基因的表达,改变植株木质素的沉积。

根据Liu等[21]的研究,PtrLBD12基因上游的调控因子PtrbHLH186在毛果杨中作为MYB转录因子的下游因子参与木材形成的调控过程。PtrbHLH186基因的上调表达造成植株生长迟缓,木质部导管细胞孔径减少、数量增多,茎干木质化程度增加,总木质素含量增加[21]。本研究中PtrLBD12转基因植株表现出的生长特征及木材细胞结构特性与其上游调控基因PtrbHLH186转基因植株一致。本研究虽然没有对PtrLBD12转基因植株的木材组分进行精确测定,但根据组织切片化学染色及木质素单体合成酶基因的表达情况进行推测,转录因子PtrLBD12与PtrbHLH186可能具有相似的促进木质素沉积的功能。因此,毛果杨PtrLBD12转录因子作为PtrbHLH186的下游靶基因在木材形成中发挥着重要的调控功能。

在干旱条件下,树木茎干中的木质部往往有着更多、更小的导管,这样可以承受较低的水势,防止木质部导管的空化,从而更有效地传输水分[21,30]。Kasuga等[31]的研究证明,PtrbHLH186基因的上调表达使植株形成更多、更小的导管细胞,这样的细胞特性增强了植株的耐旱能力。而PtrLBD12过表达毛果杨植株的导管细胞同样具有这种特征,因此这种细胞特性的改变很有可能使转基因植株具有更强的抵御干旱胁迫能力。此外,降低植株的生长量也是植物度过水分匮乏时期的重要应对策略。植株也会通过促进木质素的合成从而抵御胁迫[32]。本研究中的过表达植株也表现出生长量降低、木质素沉积受到促进的表型,这进一步说明了PtrLBD12过表达可能增强植物耐旱性。但PtrLBD12基因响应干旱胁迫的功能和机制等问题还需要进一步探究。

选育产量高、品质优、抗性强、适应性广的林木品种并应用于生产是未来林木遗传育种的发展趋势和重点方向[33]。本研究初步探讨了转录因子PtrLBD12对毛果杨木材形成和生长发育的影响,明确了该基因对杨树木质部细胞形态和结构的影响,为转录因子介导的木材形成调控机制的解析和林木的遗传改良提供重要的理论线索,也为利用基因编辑等基因工程手段创制优质、高抗、高产的林木新品种提供重要的、优良的候选基因资源。