基于Nrf 2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

王靖雯， 吴苗苗， 李莉娟,2， 顾泽茂,2， 袁军法,2*

(1. 华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070；2. 华中农业大学，水生动物疫病专业实验室，湖北 武汉 430070)

水生动物病毒病种类多、流行广、传播快、死亡率高，是限制水产养殖业绿色发展的重要因素[1-2]。因抗病毒药物缺失、疫苗种类有限，水生动物病毒病的防控始终是水产养殖中的难点，筛选绿色、广谱的抗病毒药物，建立高效防控技术体系是水生动物病毒研究的核心目标[3-4]。氧化应激是鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)等多种病毒感染的主要病理机制之一[5-6]。抗氧化通路作为一种内源性的防御机制，除维持机体氧化-还原平衡稳态外，还可拮抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和SVCV等多种病毒，而萝卜硫素、雷公藤红素等作为药食同源的抗氧化剂，也被证实具有较好的抗病毒作用[7-8]。因此，靶向抗氧化通路，筛选具有抗病毒作用的抗氧化剂，可为开发绿色、广谱的抗水生病毒药物提供新思路[9]。

核转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞中氧化应激的主要传感器，可启动下游包括血红素加氧酶1(HO-1)在内的抗氧化及解毒基因的转录与翻译[10]。HO-1是将血红素分解为胆绿素、Fe2+和CO的关键酶，在维持机体氧化还原平衡方面起关键作用[11-12]。此外Nrf2/HO-1信号通路还广泛参与到机体的生长、分化、代谢、免疫等多种生命过程中，通过其下游醌氧化还原酶1(NQO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化/二相解毒酶维持机体的稳态[13-14]。Nrf2/HO-1信号通路是机体最重要的抗氧化防御系统，姜黄素、萝卜硫素、雷公藤红素等药物可通过激活Nrf2介导的HO-1表达来缓解病毒感染引起的氧化应激并抑制病毒复制[7-8,15-16]。靶向Nrf2/HO-1信号通路的抗病毒药物，通过激活抗氧化和抗炎症等内源性防御通路发挥作用，具有广谱性。这些药物不直接作用于病毒本身，减少了耐药性的产生，为开发绿色高效的抗病毒药物提供了靶标。

胖头鱥上皮细胞(FHM)对SVCV、RGV、大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus，MSRV)、传染性胰脏坏死病毒 (infectious ancreatic necrosis virus，IPNV) 等多种水生动物病毒敏感，是病毒诊断、致病机制与病毒复制规律研究的重要材料[17-19]。本实验利用胖头鱥(Pimephales promelas)基因组数据，分析并构建了Nrf2、HO-1启动子报告质粒，建立靶向其启动子活性的药物筛选方法，为抗水生动物病毒的药物筛选提供了基础工具和新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用FHM细胞系、SVCV、RGV均为本实验室保存。

1.2 药物与主要试剂

DNA提取试剂盒购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司；2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye) 、胶回收试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司；DNA Marker、DH5α菌株购自北京擎科新业生物技术有限公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；低内毒素真核质粒提取试剂盒购自Magen公司；胎牛血清、M199培养基、0.25%EDTA胰酶以及OPTI-MEM培养液购自Gibco；FishTrans转染试剂购自武汉美森特生物科技有限公司；姜黄素[95%(HPLC)，S19245]、白藜芦醇(BR, 98%，S30630)、穿心莲内酯(98%，S24818)、水飞蓟宾[98%(HPLC)，Y53945]购自上海源叶生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自Biosharp公司；pGL3- Basic、pRLTK1、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；pTOPO001 Simple Cloning Kit载体试剂盒购自北京金沙生物科技有限公司；TRIzol、反转录及定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；引物合成与测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.3 FHM Nrf2、HO-1基因启动子的生物信息学分析

利用NCBI数据库[National Center for Biotechnology Information (nih.gov)]获取FHMNrf2(Gene ID: 120459756、NCBI Reference Sequence:XM_039647189.1)和HO-1(Gene ID: 120467971、NCBI Reference Sequence: XM_039656609.1)的基因组DNA序列及mRNA序列，利用AnimalTFDB3.0[AnimalTFDB3 (hust.edu.cn)]、JASPAR(JASPAR -A database of transcription factor binding profiles(genereg.net))在线软件对转录因子结合位点进行预测。利用MethPrimer软件[MethPrimer | Tools and Databases | The Li Lab (urogene.org)]预测CpG岛。

1.4 质粒载体的构建

根据胖头鱥基因组序列设计扩增引物(表1)，上下游引物的酶切位点以下划线表示。提取FHM细胞的DNA，进行PCR扩增。 PCR体系共20 μL∶2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye)10 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL 。反应程序∶95 °C预变性3 min，94°C变性 25 s，根据引物Tm值设置退火温度，退火25 s，72 °C延伸(10～15 s / kb )，35个循环；72°C延伸5 min。PCR 产物经 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测有明亮单一条带后切胶回收。将纯化后的扩增产物与pGL3-basic 载体进行双酶切处理。回收纯化后的启动子片段和载体按物质的量 3∶1 混合，T4 DNA 连接酶 16 °C连接 12 h，转化入DH5α 感受态细胞，涂布氨苄西林(Amp)抗性的平板，37 °C倒置培养12 h。对单菌落进行菌液PCR检测，将阳性菌送测序，验证序列是否正确。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 细胞培养及瞬时转染

FHM细胞用含有10% FBS的M199培养基培养，培养温度为28 °C，待细胞平铺长满孔板的80%～90%进行转染。转染试剂、质粒的配比及操作步骤按FishTrans转染试剂使用说明进行。

1.6 启动子活性分析

为评价药物的细胞毒性，使用含不同浓度药物的培养基(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)对FHM进行药物处理，同时设置阴性对照 (negative control, NC) 和二甲基亚砜 (DMSO)组，每个浓度设置6个重复，28 °C继续培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂在培养箱内继续孵育2.5 h，酶标仪于450 nm处测量吸光值，计算细胞活力。

转染重组启动子质粒及pRL-TK质粒24 h后，将白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯和姜黄素4种药物以10.0 μg/mL的浓度同细胞孵育，28 °C作用24 h后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明进行荧光素酶活性检测。再次转染重组启动子质粒及pRL-TK质粒，24 h后将上述初步筛选有效的药物—水飞蓟宾、穿心莲内酯、姜黄素，进行梯度稀释，选取基于药物细胞毒性实验确定的6个药物浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0 μg/mL)对细胞进行处理，28 °C作用24 h后，检测药物浓度梯度对启动子活性的影响。

1.7 抗病毒实验

以6.3 μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯分别预处理细胞6 h，再分别以0.1感染复数 (multiplicity of infection，MOI)的SVCV和RGV进行感染，28 °C孵育1 h后更换为含相应药物浓度的培养基继续培养。收取细胞上清液及细胞样，测定病毒滴度及病毒复制水平，验证基于启动子活性的药物筛选策略。将收集的细胞培养上清连续10倍稀释(10−1～10−10)，每个梯度6个重复，加入细胞培养板，每孔100 μL，同时用稀释液做阴性对照，培养7 d后观察并记录全部孔的细胞病变，再根据Reed-Muench两氏法计算出病毒滴度。

以RGV9506 (GenBank: JQ654586.1)的MCP序列(ORF97R)设计引物，建立RGV的绝对定量方法，评价药物对RGV感染的影响。提取细胞样DNA，以RGV感染组DNA样品为模板进行PCR扩增，回收后按pTOPO001 Simple Cloning Kit载体试剂盒说明进行连接、转化及阳性克隆的鉴定。提取标准重组质粒并测量浓度，然后依据公式计算每微升样品中质粒拷贝数∶每微升质粒拷贝数( 拷贝 / μL) = 质粒总质量( μg / μL) /质粒分子量；质粒分子量 = 2 × 330 × nt(其中 nt 为质粒的碱基数) 。标准重组质粒进行10倍的梯度稀释后定量检测，得到标准曲线。提取细胞样的DNA，进行实时荧光定量PCR(qPCR) 实验对 RGV进行定量，RGV定量引物如表1所示。定量检测SVCV-G的转录水平，评价药物对SVCV复制的影响。提取细胞样的总RNA并反转录为cDNA后进行qPCR，对SVCV G蛋白的mRNA水平进行定量检测，SVCV-G定量引物如表1所示。

1.8 统计分析

所有实验数据均采用双样本等方差t检验进行处理，*，P＜ 0.05； **，P＜ 0.01 或 ***，P＜ 0.001。

2 结果

2.1 Nrf2、HO-1基因启动子的生物信息学分析

通过NCBI数据库获取Nrf2和HO-1的DNA序列，分别选取编码区(CDS区)起始密码子ATG前后2482和2104 bp作为Nrf2和HO-1基因启动子候选区，利用Animal TFDB3.0、JASPAR等软件分别对Nrf2和HO-1启动子区的转录因子结合位点进行预测，结果显示，Nrf2和HO-1启动子区存分别存在FOXO、ATF、IRF、AP-1、FOS和Nrf2、Bach1、SP-1、STAT等多种潜在转录因子结合位点(图1)。利用MethPrimer预测到Nrf2启动子中存在一个CpG岛，位于2125～2243 bp，而HO-1启动子中存在3个CpG岛，分别位于53～156 bp、704～852 bp、1156～1276 bp(图2)。

图1 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因启动子区转录因子结合位点预测Fig. 1 Predicted transcription factor binding sites in the promoter region of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

图2 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因启动子序列CpG岛预测结果Fig. 2 Predicted results of CpG islands of promoter sequences of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

2.2 Nrf2和HO-1基因启动子片段的扩增和报告载体的构建

构建FHMNrf2、HO-1启动子报告质粒(图3-a)。PCR扩增Nrf2和HO-1基因启动子片段，回收后分别使用KpnⅠ、XhoⅠ和XhoⅠ、Hind III限制性内切酶对扩增片段及pGL3-Basic进行双酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果(图3-b)。结果显示，在2000 bp附近及2000～3000 bp存在单一明亮的特异性条带，与预期的大小一致，经连接、转化、阳性单克隆菌液PCR及测序后确认获得pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1重组双荧光素酶质粒。

图3 FHM Nrf2、HO-1启动子报告质粒的构建(a) Nrf2、HO-1启动子报告质粒构建流程图，(b) Nrf2基因启动子片段及pGL3-Basic质粒的双酶切，(c) HO-1基因启动子片段及pGL3-Basic质粒的双酶切；1. pGL3-Basic质粒双酶切产物，2. Nrf2基因启动子片段双酶切产物，3. pGL3-Basic质粒双酶切产物，4. HO-1基因启动子片段双酶切产物，M. 分子质量标准DL5000。Fig. 3 Construction of FHM Nrf2 and HO-1 promoter reporter plasmids(a) flow chart for the construction of FHM Nrf2, HO-1 promoter reporter plasmid, (b) double digestion of Nrf2 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid, (c)double digestion of HO-1 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid; 1. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 2. Nrf2 gene promoter fragment double digestion product, 3. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 4. HO-1 gene promoter fragment double digestion product, M. molecular quality standard DL5000.

2.3 基于启动子活性的药物筛选

选取白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯和姜黄素4种中草药有效成分来探究药物对Nrf2和HO-1启动子活性的影响，验证启动子的活性。细胞毒性实验显示，4种药物的浓度在25.0 μg/mL以下时对细胞无明显毒性(图4)，当浓度升至50.0 μg/mL时，除姜黄素外，其他3种药物的细胞存活率均大于70%。

以10.0 μg/mL的药物浓度进行初步筛选实验。结果显示，水飞蓟宾和姜黄素可显著上调Nrf2的启动子活性，而穿心莲内酯和姜黄素则可显著上调HO-1的启动子活性(图5)。选取以上3种有效药物，对不同浓度药物刺激下的启动子活性进行检测，结果显示，6.3 μg/mL的水飞蓟宾可有效上调Nrf2和HO-1的启动子活性；穿心莲内酯各浓度均未能显著激活Nrf2的启动子，相反，3.1～50.0 μg/mL的穿心莲内酯均可显著激活HO-1启动子，其中6.3 μg/mL的效果最为显著；姜黄素中除因药物毒性导致细胞大量死亡的50.0 μg/mL，其他浓度均可显著上调Nrf2的启动子活性，但只有6.3 μg/mL的姜黄素浓度可显著上调HO-1的启动子活性(图6)。

图5 四种药物对Nrf2 (a)、HO-1 (b) 启动子活性的影响1. 对照，2. 白藜芦醇，3. 水飞蓟宾，4. 穿心莲内酯，5. 姜黄素；*.表示差异显著(P＜0.05)；下同。Fig. 5 Effects of four drugs on Nrf2 (a) and HO-1 (b)promoter activity1. control, 2. resveratrol, 3. silybin, 4. andrographolide, 5. curcumin; *.means the difference is significant (P＜0.05); the same below.

图6 不同药物浓度对Nrf2、HO-1启动子活性的影响(a)～(c)分别表示不同浓度的水飞蓟宾、穿心莲内酯和姜黄素对Nrf2启动子活性的影响，(d)～(f)分别表示不同浓度的水飞蓟宾、穿心莲内酯和姜黄素对HO-1启动子活性的影响；1. NC，2. 3.1 μg/mL，3. 6.3 μg/mL，4. 12.5 μg/mL，5. 25.0 μg/mL，6. 50.0 μg/mL。Fig. 6 Effect of different drug concentrations on the activity of Nrf2 and HO-1 promoters(a)-(c)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on Nrf2 promoter activity, (d)-(f)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on HO-1 promoter activity; 1. NC，2. 3.1 μg/mL, 3. 6.3 μg/mL, 4. 12.5 μg/mL, 5. 25.0 μg/mL, 6.50.0 μg/mL.

2.4 抗病毒活性

为验证姜黄素和穿心莲内酯激活Nrf2和HO-1的启动子是否与抗病毒活性关联，分别以姜黄素和穿心莲内酯对FHM细胞进行孵育，再分别以RGV和SVCV感染FHM，以含相应浓度药物的维持培养基继续培养。结果显示，SVCV和RGV感染可诱导细胞产生明显的CPE，姜黄素和穿心莲内酯的处理可显著缓解病毒感染引起的细胞病变(图版)。

构建的RGV荧光定量标准曲线(y=-3.413x+40.60)具有较好的线性关系(图7)。姜黄素处理组和穿心莲内酯处理组可分别减少约40%和60%的RGV拷贝量；姜黄素处理组和穿心莲内酯处理组较对照组分别下调约20%和60%的SVCVG水平。滴度结果也证实，药物处理可减少培养基上清中的病毒粒子含量，其中穿心莲内酯的效果更为显著，RGV和SVCV的病毒滴度分别下降了25%和23%(图8)。

图7 靶向MCP基因的RGV定量标曲Fig. 7 Quantitative standard curve of RGV targeting MCP gene

图8 药物的抗病毒活性检测(a) 绝对/相对定量检测病毒的复制水平，(b) 药物处理后病毒的滴度检测；1. 病毒感染组，2. 姜黄素组，3. 穿心莲内酯组。Fig. 8 Detection of antiviral activity of drugs(a) absolute/relative quantification of viral replication levels, (b) titer detection of viruses after drug treatment; 1. virus infection group, 2. curcumin group, 3. andrographolide group.

3 讨论

启动子是基因的开关，位于结构基因5‘端的上游，与转录因子一起，从起始时间和表达程度上对基因的转录进行调控[20]。本实验对Nrf2、HO-1启动子区的转录因子结合位点及CpG岛进行了预测。Nrf2启动子序列中预测到的潜在转录因子结合位点较为分散，其中存在与细胞增殖、凋亡、分化和炎症相关的ATF家族，涉及细胞生长发育及代谢周期调控的FOX家族，以及IRF 家族的结合位点。HO-1启动子序列中的潜在转录因子结合位点较为集中，其中FOS、JUN、MAF、BACH1、AP-1、Nrf2等HO-1转录调控中常见的转录因子集中在1240～1260 bp。在人(Homo sapiens)的HO-1启动子序列中同样预测到IRF-1、AP-1和STAT的结合位点[21]。CpG岛主要分布在启动子区，CpG岛的甲基化可影响转录因子的结合，对基因的表达产生负调控作用[22]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)的Nrf2启动子中存在2个CpG岛，且急性缺氧可显著降低CpG岛的甲基化，促进Nrf2的表达。与牙鲆不同，胖头鱥的Nrf2启动子中预测到1个CpG岛[10]。 人类的HO-1启动子区中存在一个长307 bp的CpG岛，而胖头鱥的HO-1启动子中预测到3个预测的CpG岛[21]。此外研究表明，Nrf2启动子区域rs13005431位点的多态性变化会改变Nrf2的转录活性，影响对结核病的易感性；哺乳动物的HO-1启动子的多态性也被证明与肺部和心脑血管等疾病密切相关[23-24]。但水生动物鲜有启动子多态性与疾病联系的相关研究，相关研究的展开将对抗病育种具有积极意义。

近年来，关于Nrf2/HO-1信号通路参与病毒复制及病理机制的研究逐渐深入。Nrf2和HO-1具有广谱的抗病毒活性，HO-1可诱导IFN-1表达并抑制HCV的NS3/4A蛋白酶活性；Nrf2介导的HO-1表达还可抑制寨卡病毒(Zika virus，Zika)及单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)等病毒的增殖[7,25-26]。研究已证实多种药物可靶向Nrf2和HO-1信号通路发挥抗病毒作用∶青蒿的类黄酮衍生物DMO-CAP处理可诱导p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、JNK/MAPK和ERK/MAPK磷酸化，激活Nrf2/HO-1，抑制甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的增殖[27]；青蒿琥酯通过激活AMPK依赖的Nrf2/HO-1信号通路来抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的复制[28]。鱼类中也有研究表明，萝卜硫素、香豆素衍生物BBC和α-脂质酸可靶向于Nrf2/HO-1通路抑制SVCV和病毒性出血败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)[8,29-30]。靶向内源性防御通路Nrf-2/HO-1的抗病毒策略为广谱抗病毒药物的筛选提供了新的思路，基于此，本实验构建了Nrf2、HO-1的启动子报告质粒，评价了靶向Nrf2/HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法。该方法利用灵敏度高、检测线性范围广的荧光素酶报告系统，以荧光信号强度定量表示启动子活性的强弱。与靶向病毒基因的药物筛选方式相比，该方法不受病毒种类的限制，适用于所有可引起氧化应激的水生生物病毒，具有广谱性，也不易产生耐药性[31]。与基于活体实验及细胞病变程度的传统药物筛选方法相比，该方法筛选周期短，易于操作与重复，可用于抗水生病毒药物初筛[32]。

姜黄素可通过PKC的磷酸化激活Nrf2；穿心莲内酯可通过p38/MAPK的磷酸化促使Nrf2入核介导HO-1的表达，以发挥其抑制HCV、COVID-19等多种病毒的抗病毒作用[15,33-35]。本研究也证实姜黄素和穿心莲内酯可激活FHMNrf2、HO-1的启动子活性，抑制RGV和SVCV的增殖。白藜芦醇是常见的多酚之一，被普遍认为具有抗氧化、抗癌症等功能。研究表明白藜芦醇在3.1～100.0 μmol/L时均可显著激活HEK293T细胞中抗氧化元件(ARE)的启动子活性，在50.0 μmol/L时可激活PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路以减轻氧化应激诱导的肠道屏障损伤。本实验以10.0 μg/mL的浓度进行药物初筛时，白藜芦醇并未激活FHMNrf2、HO-1的启动子活性[36-38]。随着对白藜芦醇研究的逐渐深入，其保护作用开始出现争议∶白藜芦醇可增强HCV的复制，不适用于慢性丙型肝炎的抗氧化治疗；存在双相刺激剂量依赖性反应及昼夜节律，即在低剂量下及暗期为抗氧化剂，存在保护作用，高剂量下及光照期作为促氧化剂，通过下调PKB/Akt的磷酸化增加氧化应激[36,39-41]。这些均表明白藜芦醇的抗氧化效应在不同细胞、浓度、状态下不同。

本实验分析并构建了胖头鱥Nrf2、HO-1启动子报告质粒，并在此基础上建立了基于抗氧化信号通路的抗病毒药物筛选方式，分别以DNA病毒RGV和RNA病毒SVCV验证了该药物筛选方式的有效性，为鱼类抗病毒药物的高效快速筛选提供了新方法。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）