一例混合感染奶牛乳房炎病例病原菌分离鉴定及药敏试验

曹 芳，魏 勇，吴 忧，王晨豫，赵鹏飞，李智星， 任静静，齐亚银

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003

2 新疆天润科技股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830063

0 引言

乳房炎是奶牛最重要且常见的疾病之一，会导致奶牛产奶量和牛奶品质下降，亦可导致机体免疫力下降。奶牛乳房炎主要症状为乳房实质、间质的炎症，表现为红、肿、热、痛等。根据有无临床症状，将奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎[1]。研究发现，已有超过180 种病原菌会引起奶牛乳房炎[2，3]。奶牛乳房炎主要是由于链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和支原体所致，此外，环境性链球菌、肠球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等也可引起乳房炎[4，5]。

目前，抗生素治疗乳房炎仍是最常见的手段，但广泛长期使用致使很多病原菌产生耐药性，有的甚至出现多重耐药现象，不但对奶牛造成不可挽回的伤害，并且严重危及养殖业发展。

近年来，随着新疆奶牛养殖业发展，乳房炎发病率逐年升高，规模化牧场奶牛乳房炎发病情况更突出，因此，针对典型临床型奶牛乳房炎病例无菌采集奶样，进行实验室分离鉴定及药敏试验，为该牧场的奶牛乳房炎防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例来源及试验地点

本研究样品于2023年7月份取自新疆某规模化牧场典型患乳房炎奶牛奶样，临床诊断均在牧场进行，后期的实验室检测于石河子大学动物科技学院反刍动物重要疫病防控研究室进行。

1.2 试验仪器设备

光学显微镜（光学显微镜）、恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、PCR扩增仪（Techne公司）、凝胶成像系统（Biorad公司）。

1.3 主要试剂

脑心浸出液肉汤（BHI）液体培养基，麦康凯琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基，沙门、志贺菌属琼脂培养基（ss）琼脂培养基，梭菌鉴别琼脂培养基，厌氧培养基，甘露醇盐琼脂培养基，Baird-Parker琼脂培养基，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.4 临床诊断与采样

对体细胞数超过50 万个/mL的奶牛乳房组织进行视诊及触诊，针对最典型症状的临床型乳房炎奶牛，对乳头消毒处理后，弃去采样乳区的前3 把乳样[6]，无菌采集7 mL左右奶牛乳液至15 mL无菌离心管中，4 ℃保存备用。

1.5 病原菌分离纯化

将奶样无菌接种于BHI液体培养基，置于37 ℃摇床过夜培养。涂片固定后进行革兰氏染色，在显微镜下观察，初步确定相关病原菌。

将观察到的相关菌液分别无菌划线接种于伊红美蓝琼脂培养基、ss琼脂培养基、甘露醇盐琼脂培养基、梭菌鉴别琼脂培养基，置37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。挑取各鉴别平板上的典型单菌落接种于BHI液体培养基、厌氧培养基，置于37 ℃摇床过夜培养。分别将划线接种于麦康凯琼脂培养基、Baird-Parker琼脂培养基、梭菌鉴别琼脂培养基，37 ℃培养24～48 h。继续挑取典型单菌落接种于BHI液体培养基（梭菌鉴别平板上的菌落接种于厌氧培养基），置于37 ℃全自动震荡培养箱中过夜培养，分别镜检，观察。

1.6 PCR鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤，提取细菌总DNA，-80 ℃储存备用。根据大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梭菌[7]特异性引物进行PCR扩增，引物序列见表1，反应体系是25 µL：2×Taq Plus Master mix Ⅱ为10 µL，上下游引物各为0.5 µL，ddH2O为 12 µL，cDNA模板为2 µL。反应条件：95 ℃预变性，2 min；95 ℃变性，30 s，55 ℃退火 ，30 s，72 ℃延伸，50 s，30个循环；72 ℃终延伸，10 min。

表1 引物

PCR扩增反应完成后，进行凝胶电泳试验，在凝胶成像系统仪下观察，若出现与引物相应大小条带则为目的条带。

1.7 药敏试验

取营养肉汤增菌培养后的菌液，用移液枪吸取100 µL均匀涂抹到整个营养琼脂培养基[8]，贴药敏纸片，37 ℃倒置培养24～48 h，判定结果参照美国临床实验室国家标准化管理委员会标准（CLSI2008）[9]。

2 结果

2.1 临床诊断结果

视诊观察发现患乳房炎奶牛乳房明显红肿；触诊发现乳房硬胀，并且发热（图1）。

图1 患乳房炎奶牛乳房局部照片

2.2 病原菌分离纯化结果

通过革兰氏染色镜检，初步观察到3 类病原菌：①革兰氏阴性短杆状，单个或成对病原菌。②革兰氏阳性粗大且两端钝圆的杆菌。③革兰氏阳性呈葡萄状的球菌（图2a、2b）。

图2 初步镜检结果

将观察到的病原菌接种于鉴别培养基后，麦康凯琼脂培养基长出圆形、金属红色光泽菌落（图3a）；伊红美蓝琼脂培养基长出紫黑色，并带有绿色金属光泽菌落（图3b）；甘露醇盐琼脂培养基长出黄色菌落且菌落周围也为黄色（图3c）；Baird-Parker琼脂培养基长出黑色菌落（图3d）；梭菌鉴别琼脂培养基长出黑色菌落（图3e）。

图3 接种于鉴别培养基后的镜检结果

鉴定后判定上述革兰氏阴性杆菌为大肠杆菌，革兰氏阳性球菌为金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性杆菌为梭菌，见图4a、4b、4c。

图4 病原菌鉴定后的镜检结果

2.3 PCR鉴定结果

PCR扩增结果如图5a、5b、5c所示，可分别观察到287 bp（大肠杆菌）、196 bp（金黄色葡萄球菌）、478 bp（梭菌）条带，大小与预期符合。

图5 PCR鉴定结果

2.4 药敏试验结果

由表2可知，大肠杆菌对复方新诺明、卡那霉素、恩诺沙星、环丙沙星高度敏感，其中环丙沙星极度敏感；金黄色葡萄球菌对复方新诺明、卡那霉素、恩诺沙星、氯霉素极度敏感；梭菌对氯霉素、头孢曲松、氨苄西林高度敏感。分离得到3 种细菌均出现多重耐药现象。

表2 药敏试验结果

3 讨论

对该规模化牧场典型乳房炎病例进行采样鉴定后，发现奶牛乳房炎多由于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梭菌感染所致。与新疆地区常见奶牛乳房炎分离到的病原类型一致[10，11]，并且不同细菌呈现不同耐药情况，建议该牧场对患病牛采取隔离措施，并配合使用替米考星、头孢噻呋钠、及梭菌疫苗进行联合用药治疗。

乳房炎为奶牛养殖业临床常见疾病，主要由于病原体感染所致。新疆地区长期干燥，昼夜温差较大，奶牛更易发生乳房炎。因此，该地区通常采取“预防为主，治疗为辅”的防治措施。在预防方面，定期检测乳房健康状况，保持圈舍环境卫生及奶牛体表清洁，保证挤奶卫生，坚持乳头药浴，还应加强干奶期隐性乳房炎防治，对于已患乳房炎奶牛，应根据不同病因采取措施，合理用药。

在治疗方面，虽然抗生素对奶牛乳房炎治疗至关重要，但随着大量长期不合理的使用，出现大量耐药菌株，且耐药性越来越高，这提示养殖户应合理使用抗生素，平时在奶牛及牛舍消毒卫生管理方面多下功夫，以达到良好预防疾病效果。

4 结论

本研究通过对该牧场乳房炎奶样进行病原菌分离鉴定发现，该牧场奶牛乳房炎是由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及梭菌混合感染所致。药敏试验显示，3 种菌对多种抗生素产生了不同的耐药效果，其中大肠杆菌及金黄色葡萄球菌对复方新诺明、恩诺沙星、氯霉素相对敏感。建议该牧场对患病牛采取隔离措施，并配合使用替米考星、头孢噻呋钠、及梭菌疫苗进行联合用药治疗，以期达到良好的治疗效果。