芥子碱硫氰酸盐提高卵巢癌SKOV3细胞对吉西他滨敏感性的研究*

牛庆玲,王雅莉,王 卓

(郑州市中心医院妇产科, 河南 郑州 450007)

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,由于早期无明显临床症状,发现时多已进展为晚期[1]。初始治疗后患者3年累积复发率仍高达70%,5年总生存率不足50%,化疗耐药是该病高复发率和高病死率的根本原因[2]。吉西他滨(gemcitabine,GEM)是阿糖胞苷类似物,临床不良反应少,可延长卵巢癌复发患者的无进展生存期,改善预后[3]。芥子碱硫氰酸盐是提取自莱菔子的生物碱,具有抗炎、抗氧化和抗血管生成作用[4]。近年来有实验[5]表明,其可抑制胶质瘤T98细胞增殖、迁移及侵袭,同时诱导细胞凋亡,表现出良好的抗肿瘤功效。但目前关于其对肿瘤细胞化疗增敏的影响鲜有报道,且缺乏相应机制研究。本研究通过体外培养卵巢癌SKOV3吉西他滨耐药细胞(SKOV3/GEM细胞),观察芥子碱硫氰酸盐对SKOV3细胞GEM敏感性的影响,探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人卵巢癌SKOV3细胞株,购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与仪器

芥子碱硫氰酸盐,纯度98%,北京索莱宝科技有限公司产品,批号SS9190;表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激动剂NSC 228155,上海沪峥生物科技有限公司产品,批号113104-25-9;GEM,仁合熙德隆药业有限公司产品,批号022306302;兔抗人血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2(Ephreceptor tyrosine kinase A2,EphA2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化EGFR(phosphorylated EGFR,p-EGFR)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR (phospho-mTOR,p-mTOR)一抗,均为美国艾博抗公司产品,批号依次为ab205336、ab212069、ab52894、ab32086、ab38449、ab8805、ab134903、ab278621。Epoch酶标仪,美国伯腾仪器有限公司产品;Cyto FLEX2流式细胞仪,美国贝克曼库尔特有限公司产品;BX53光学显微镜,日本奥林巴斯公司产品。

1.3 SKOV3/GEM细胞的培养与分组

按照参考文献[6-7]进行。取人卵巢癌SKOV3细胞株,温水浴解冻,置于RPMI-1640培养基(100 mL/L 胎牛血清,青霉素和链霉素各100 U/mL),在37 ℃、50 mL/L CO2条件下培育,待细胞融合至80%,胰酶消化、传代;取对数期细胞培育耐药细胞株。采用浓度递增法建立SKOV3细胞吉西他滨耐药株SKOV3/GEM,培养液内加入质量分数5 mg/L的GEM,培养48 h;弃培养基,更换为完全培养基使细胞恢复生长,再次加入质量分数10 mg/L的GEM;反复提高药物质量分数(5、10、20、40 mg/L)换液传代,直至细胞可稳定生长于RPMI-1640培养液中(GEM最终质量分数40 mg/L),后续实验开始前一周更换为完全培养基正常培养。

取对数期SKOV3/GEM细胞,清洗,重悬,以1×105个/mL接种于96孔板,待细胞融合至80%,随机分为耐药组、干预组、激动剂组、联合组。耐药组以完全培养基常规培养,干预组培养基加入芥子碱硫氰酸盐(终浓度100 μmol/L),激动剂组培养基加入NSC228155(终浓度100 μmol/L),联合组培养基加入芥子碱硫氰酸盐(100 μmol/L)和NSC 228155(100 μmol/L)。各组均干预48 h用于后续实验。

1.4 检测指标

1.4.1 SKOV3、SKOV3/GEM细胞的GEM敏感性

采用CCK-8法检测不同质量分数GEM下SKOV3、SKOV3/GEM细胞增殖抑制率。分别取对数期SKOV3、SKOV3/GEM细胞,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗,胰酶消化,重悬,以1×105个/mL接种于96孔板,待细胞融合至80%,每孔加入含GEM(质量分数分别是10、50、100、200、400 mg/L)RPMI-1640培养液,48 h后加入10 μL CCK-8溶液,4 h后吸弃上清,加入二甲基亚砜振荡5 min,采用酶标仪检测450 nm处吸光度值,计算增殖抑制率和半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。增殖抑制率(%)=(1-各质量分数GEM孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%

1.4.2 各组SKOV3/GEM细胞增殖抑制率

按1.3项下分组。采用CCK-8法检测。取干预后的各组细胞,洗涤,重悬,接种,加入终浓度为400 mg/L的GEM,培养48 h后,加入CCK-8试剂继续孵育4 h,经酶标仪检测450 nm处吸光度值,计算各组细胞增殖抑制率。

1.4.3 SKOV3/GEM细胞凋亡率

取干预后的各组SKOV3/GEM细胞,清洗,重悬后,以1×105个/mL接种于6孔板,加入终浓度400 mg/L的GEM,常规培养48 h,PBS清洗,低温离心机离心(半径10 cm,2 500 r/min)8 min,弃上清,结合缓冲液重悬细胞,再加入异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V、碘化丙啶各5 μL,经流式细胞仪分析细胞凋亡情况,计算各组细胞凋亡率。

1.4.4 细胞血管生成能力

通过血管生成拟态实验检测。取Matrigel 胶,4 ℃过夜解冻,与RPMI-1640培养液融合后铺于96孔板,取干预后的各组SKOV3/GEM细胞,胰酶消化、重悬,以1×104个/mL接种至该孔板,培养箱标准条件培养24 h,光镜下选取5个不相邻视野拍照,观察各组细胞血管生成情况。

1.4.5 VE-cadherin、EphA2蛋白表达量

取干预后的各组SKOV3/GEM细胞,PBS清洗后移至离心管,加入RIPA裂解液,以10 cm离心半径、10 000 r/min转速低温离心15 min,经BCA试剂盒测量总蛋白并定量。取40 μg待测蛋白,混合4倍体积上样缓冲液,沸水浴变性蛋白,离心取上清,加载至聚丙烯酰胺凝胶,恒压下电泳分离并转至PVDF膜,50 mL /L脱脂牛奶封闭2 h,加入兔抗人VE-cadherin、EphA2一抗(1∶500),4 ℃冷藏过夜,TBST缓冲液清洗,加入二抗(1∶2 000),摇床孵育2 h,TBST缓冲液清洗,增强型化学发光试剂发光,暗室显影,采用成像分析仪分析蛋白条带灰度值。以VE-cadherin、EphA2蛋白灰度值与内参GAPDH的灰度值的比值代表该蛋白相对表达量。

1.4.6 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达量

取干预后的各组SKOV3/GEM细胞,清洗,裂解,定量,变性,电泳分离,转膜,封闭,方法同1.4.5;加入兔抗人EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(1∶500),4 ℃冷藏过夜,TBST缓冲液清洗,加入二抗(1∶2 000),摇床孵育2 h,TBST缓冲液清洗,电化学发光液发光,暗室显影,经成像分析仪分析蛋白条带灰度值,以EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白灰度值与内参GAPDH的灰度值的比值代表该蛋白相对表达量。计算p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 不同质量分数GEM下SKOV3、SKOV3/GEM细胞增殖抑制率对比

不同质量分数GEM下,SKOV3、SKOV3/GEM细胞增殖抑制率对比,差异均有统计学意义(P<0.01),且SKOV3/GEM细胞增殖抑制率低于SKOV3细胞(P<0.01)。见表1。SKOV3/GEM细胞IC50为(210.59±15.24)mg/L,高于SKOV3细胞(78.57±9.15)mg/L,表明耐药株SKOV3/GEM建立成功。

表1 不同质量分数GEM下SKOV3、SKOV3GEM细胞增殖抑制率对比

2.2 各组SKOV3/GEM细胞增殖抑制率对比

与耐药组对比,干预组KOV3/GEM细胞增殖抑制率升高(P<0.01),激动剂组KOV3/GEM增殖抑制率降低(P<0.01);与干预组对比,联合组增殖抑制率降低(P<0.01);与激动剂组对比,联合组增殖抑制率升高(P<0.01)。结果表明芥子碱硫氰酸盐可抑制SKOV3/GEM细胞增殖。见表2。

表2 各组KOV3/GEM细胞增殖抑制率对比

2.3 各组SKOV3/GEM细胞凋亡率对比

与耐药组对比,干预组SKOV3/GEM细胞凋亡率升高(P<0.01),激动剂组凋亡率降低(P<0.01);与干预组对比,联合组凋亡率降低(P<0.01);与激动剂组对比,联合组凋亡率升高(P<0.01)。结果表明芥子碱硫氰酸盐可促进SKOV3/GEM细胞凋亡。见表3。

表3 各组SKOV3/GEM细胞凋亡率对比

2.4 各组细胞血管生成能力对比

与耐药组对比,干预组管状结构数量/视野减少(P<0.01),激动剂组管状结构数量/视野增加(P<0.01);与干预组对比,联合组管状结构数量/视野增加(P<0.01);与激动剂组对比,联合组管状结构数量/视野减少(P<0.01)。见表4、图1。结果表明芥子碱硫氰酸盐可降低细胞血管生成能力。

图1 血管生成拟态实验检测细胞新生管状结构数量(×200,标尺50 μm)

表4 各组细胞血管生成能力对比 个,

2.5 各组SKOV3/GEM细胞VE-cadherin、EphA2蛋白表达对比

与耐药组对比,干预组VE-cadherin、EphA2蛋白表达降低(P<0.01),激动剂组VE-cadherin、EphA2蛋白表达升高(P<0.01);与干预组对比,联合组VE-cadherin、EphA2蛋白表达升高(P<0.01);与激动剂组对比,联合组VE-cadherin、EphA2蛋白表达降低(P<0.01)。结果表明芥子碱硫氰酸盐通过抑制EGFR/PI3K通路抑制细胞血管生成。见表5、图2。

图2 细胞VE-cadherin、EphA2蛋白表达量

表5 各组SKOV3/GEM细胞VE-cadherin、EphA2蛋白表达对比

2.6 各组KOV3/GEM细胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR对比

与耐药组对比,干预组p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01),激动剂组p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);与干预组对比,联合组p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);与激动剂组对比,联合组p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01)。结果表明芥子碱硫氰酸盐对细胞的影响通过抑制EGFR/PI3K通路实现。见表6、图3。

图3 细胞p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达量

表6 各组KOV3/GEM细胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR对比

3 讨 论

卵巢癌多发于卵巢上皮组织,可直接浸润至邻近组织器官,累及输卵管、膀胱、子宫及直肠,晚期则可通过血液转移至全身各处[8]。因当前缺乏准确筛查早期卵巢癌的有效工具,加之其无症状发展的特点,多数患者确诊时已进展至晚期,治疗后复发现象严重,探索提升复发患者化疗效果的新辅助药物势在必行。GEM是一种周期特异性抗癌药物,进入细胞后可生成竞争性底物掺入DNA,从而抑制DNA复制,诱导细胞死亡[9]。其耐药机制尚未完全阐明,多认为与糖酵解活化、凋亡抑制蛋白升高、DNA损伤修复、信号通路改变及血管新生加剧有关,其中肿瘤血管生成被认为是其重要机制之一,可激活休眠肿瘤细胞,促进肿瘤微环境建立,提升恶化潜能,从而降低药物敏感性[10]。因此,寻找高效抑制血管新生的药物是降低卵巢癌化疗耐药、提升治疗效果的关键。

VE-cadherin、EphA2是血管新生相关蛋白,其含量与血管生成拟态形成呈正相关,可代表肿瘤细胞血管生成能力[11]。卵巢癌属中医学“积聚”等范畴,主要病机为脾肾亏虚导致瘀阻于内,气滞血瘀,治疗可从活血化瘀、健脾通络方面着手[12]。莱菔子性平,味辛、甘,归脾、胃经,可健脾理气,导滞通络,具有抗菌、抗肿瘤、促进胃肠行气等作用[13]。莱菔子提取物芥子碱硫氰酸盐可抑制凝血并平衡纤维蛋白溶解,抑制纤维蛋白生成与沉积,从而抑制血管新生[14]。孙远梅等[15]研究认为,芥子碱硫氰酸盐可抑制人肝癌HepG2细胞化疗药物外排并降低多耐药蛋白表达,从而逆转化疗耐药,提示其或可成为肿瘤细胞潜在增敏药物。本研究结果显示,与耐药组对比,干预组增殖抑制率、凋亡率升高,血管生成能力、VE-cadherin、EphA2蛋白表达降低,提示芥子碱硫氰酸盐可逆转卵巢癌细胞GEM耐药,抑制血管生成,促进细胞凋亡。

EGFR是受体酪氨酸激酶家族成员,是一种细胞生理信号受体蛋白,与配体结合后发生二聚化反应磷酸化,与下游蛋白PI3K调节亚基p85结合,使其释放出催化亚基p110,与其他因子共同作用招募效应蛋白Akt至细胞内膜,Akt位点磷酸化后激活蛋白激酶mTOR,p-mTOR直接作用于底物蛋白,发挥促增殖、促侵袭、抗凋亡及促血管生成的作用[16]。Fu等[17]研究认为,抑制EGFR/PI3K/Akt/mTOR信号通路可促进食管癌吉非替尼耐药细胞凋亡、抑制其增殖,提高食管癌细胞对吉非替尼的敏感性,提示该通路或可成为抑制肿瘤细胞耐药新靶点。NSC228155是EGFR激活剂,可诱导EGFR的磷酸化,进而影响下游信号分子表达。本研究结果显示,与耐药组对比,干预组p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低,在芥子碱硫氰酸盐基础上增用EGFR激活剂NSC 228155可减弱芥子碱硫氰酸盐对卵巢癌的GEM增敏作用,提示芥子碱硫氰酸盐可能通过介导该通路抑制卵巢癌细胞血管生成并降低其GEM耐药性。

综上所述,芥子碱硫氰酸盐可抑制卵巢癌细胞血管生成并提升GEM化疗敏感性,抑制EGFR/PI3K信号通路可能是其作用机制之一。