HDAC2抑制剂CAY10683通过自噬对急性肝衰竭小鼠的保护作用*

张璐懿 石春霞 张丹眉 龚作炯

武汉大学人民医院感染科 (湖北 武汉,430061)

急性肝衰竭(ALF)是一种死亡率很高的罕见的临床疾病[1],其病理变化常表现为广泛的肝脏坏死和细胞凋亡。在过去的40年里,由于重症医学专家医疗管理的改进和紧急肝移植技术的进步,ALF患者的发病率和死亡率都有所下降。此外,人工肝治疗可以为自发性肝脏再生或紧急肝移植争取时间[2]。然而,人工肝治疗技术仍待优化,其是否能提高ALF患者的长期生存率仍需进一步验证[3]。另外,肝移植高额费用和缺乏供体等一系列问题仍然存在。因此,ALF的治疗仍然是一个严峻的临床问题。

自噬过程在维持人类健康方面至关重要,最基本作用就是适应新陈代谢的需要。肝脏是人体的一个重要代谢器官,新陈代谢和能量供应在肝脏疾病期间对肝细胞的生存起着重要作用。UNC-51样激酶1(ULK1)是一种重要的自噬分子,与肝病密切相关。ULK1的磷酸化可以保护细胞免受脂肪毒性的影响[4]。自噬和肝脏疾病的代谢之间存在着密切的联系。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是表观遗传酶,在基因调控中发挥重要作用[5]。细胞代谢和HDACs之间的相互作用可以影响许多生物过程。组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)属于Ⅰ类[6,7]。HDAC1可以对AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)进行去乙酰化和乙酰化调节,AMPK调节人肝细胞的脂质代谢和能量代谢[8]。HDAC2抑制剂CAY10683可以通过线粒体凋亡途径在ALF中保护肝脏;抑制HDAC1/2的活性可以诱导自噬,自噬蛋白的功能丧失使HDAC抑制剂失去了其保护作用[9,10]。因此,HDAC2与代谢和自噬之间都有一定的联系。本研究探讨HDAC2抑制剂CAY10683在ALF小鼠模型中对小鼠肝脏自噬和代谢的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克景达公司,饲养于武汉大学人民医院动物实验中心的无特定病原体级(SPF)环境中。选取6～8周龄且体重20～25 g的雄性小鼠进行实验。所有动物操作程序均已获得武汉大学人民医院实验动物福利伦理审查委员会的批准。

1.2 药物与试剂 D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)购于Sigma公司,CAY10683和MRT68921购于Selleck公司,抗ULK1抗体和抗β-actin抗体购于Cell Signaling Technology公司,抗苹果酸脱氢酶1(MDH1)购于Proteintech公司,葡萄糖试剂盒购于索莱宝公司,丙酮酸试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购于Elabscience公司,乳酸试剂盒购于南京建成公司。

1.3 动物模型建立及处理 将C57BL/6小鼠饲养在温度和湿度适应的SPF环境下,自由饮食,待小鼠适应环境后,选取40只小鼠随机分为5组,每组8只:正常组、模型组、CAY10683组、MRT68921组和CAY10683/MRT68921联合组。CAY10683组腹腔注射CAY10683 (3 mg/kg),MRT68921组腹腔注射MRT68921(5 mg/kg),CAY10683/MRT68921联合组腹腔注射CAY10683(3 mg/kg)和MRT68921(5 mg/kg),2 h后模型组、CAY10683组、MRT68921组和CAY10683/MRT68921联合组均腹腔注射D-Gal(400 mg/kg)和LPS(100 μg/kg)。24 h后气体麻醉小鼠,摘除眼球取血,取血后颈椎脱臼法处死小鼠,快速分离肝组织,取一部分肝组织于多聚甲醛和电镜固定液中固定,另一部分于液氮速冻30～60 s后放入冻存管中立即置于深低温冰箱保存,用于后续检测。

1.4 小鼠血清肝功能指标检测 采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平。

1.5 小鼠肝组织苏木精-伊红染色(HE)观察 肝组织固定完成后,包埋于石蜡中,切片,HE染色后封片,于正置显微镜下观察,进行图像采集。

1.6 小鼠肝组织透射电子显微镜观察 用手术刀将浸在电镜固定液中的组织切割成1 mm3的小组织块,再将其转移至装有新的电镜固定液的离心管继续固定,4%保存,完成电镜前染色和处理后,于透射电子显微镜下观察,进行图像采集。

1.7 小鼠肝组织蛋白与生化检测 清洗并称重肝组织,充分研磨裂解后4℃离心取上清液,部分用于蛋白质印迹法(Western blot)检测组织中ULK1和MDH1的相对含量,加蛋白上样缓冲液后混匀煮沸;另一部分用于生化检测,按照试剂盒说明书检测其中的葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的含量。

2 结果

2.1 各组小鼠肝组织形态及肝功能情况 正常组小鼠肝组织中的细胞排列整齐,无炎细胞浸润,而模型组小鼠肝组织中无炎细胞浸润与淤血,CAY10683降低了肝组织损伤的程度,而MRT68921加重了肝脏损伤,CAY10683对MRT68921有一定的拮抗作用,见图1A。各组小鼠ALT、AST水平见图1B、C。与正常组相比,模型组小鼠血清中ALT和AST水平大幅度增加(P<0.05);与模型组相比,CAY10683组小鼠ALT和AST水平较低(P<0.05),MRT68921组小鼠ALT和AST水平较高(P<0.05);CAY10683/MRT68921联合组小鼠ALT和AST水平低于CAY10683组(P<0.05),高于MRT68921组(P<0.05)。

与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05;与模型组、CAY10683组和MRT68921组比较,&P<0.05

2.2 各组小鼠肝细胞自噬情况 正常组小鼠细胞器清晰,线粒体无肿胀,模型组小鼠线粒体肿胀明显。在相同视野大小下,正常组小鼠的自噬小体数目较多,模型组的自噬小体数目较少。见图2。

图2 小鼠肝组织电镜下形态(黑色箭头指向自噬小体)

2.3 各组小鼠肝组织ULK1和MDH1相对表达量及糖代谢相关指标含量 与正常组相比,模型组小鼠肝组织中ULK1和MDH1的蛋白表达水平降低;与模型组相比,CAY10683组和CAY10683/MRT6892组小鼠肝组织ULK1和MDH1的蛋白表达水平升高,MRT68921组小鼠ULK1和MDH1的蛋白表达水平降低,见图3A。与正常组相比,模型组小鼠肝组织中葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高;与模型组相比,CAY10683组和CAY10683/MRT6892组小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH达水平降低,MRT68921组小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高,见图3B。

与正常组比较,# P<0.05;与D-Gal/LPS模型组比较,* P<0.05)

3 讨论

ALF发病迅速,死亡率高。D-Gal/LPS处理小鼠是一种经典的ALF造模方法。之前的研究发现,HDAC2抑制剂CAY10683对ALF小鼠具有保护作用[11]。在本研究中,HE病理和ALT、AST结果证实了其保护作用。

HDAC2与各种肝脏疾病有关。抑制HDAC2有助于预防非酒精性脂肪性肝炎[12]。HDACs过量表达可导致组蛋白乙酰化的不平衡和转录因子的改变,导致特定基因的异常抑制,从而参与疾病的发生和发展[13]。HDACs与自噬也有联系,HDACs抑制剂通过增加组蛋白乙酰化和乙酰-CoA的表达来增加机体寿命,细胞质乙酰CoA合成酶2核转位可最终导致转录因子EB的表达,导致溶酶体生物生成和自噬增加[14]。HDACs抑制剂可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,导致自噬激活[15]。生物信息学分析发现,ULK1基因表达与HDAC2表达呈负相关[11]。本研究也证明了HDAC2抑制剂CAY10683在ALF小鼠模型中对自噬的激活。

自噬是一个进化上保守的应激反应过程,它将多余的或有潜在危险的细胞内容物,如受损的线粒体或者入侵的病原体运送到自噬体中,并最终将他们送到溶酶体中降解[16]。自噬体可以通过电子显微镜进行成像,不同组的肝脏样本中自噬水平可以通过相同大小视野内的自噬小体数目进行估计。图2在一定程度上说明了各组小鼠肝脏内的自噬水平情况。ULK1是自噬的起始,其蛋白含量可以说明自噬水平的高低。CAY10683可以提高ALF小鼠中的自噬水平,CAY10683/MRT68921联合使用也在一定程度上提高了ALF小鼠的自噬水平,但是MRT68921降低了其自噬水平,因此,CAY10683可能可以拮抗MRT68921的作用,提高ALF小鼠中的自噬水平。

自噬最基本的作用是适应代谢的需要,葡萄糖代谢是人体内重要的能量供应途径。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是葡萄糖代谢的两个重要过程。糖酵解产生丙酮酸,丙酮酸可被LDH转化为乳酸,该过程在细胞质内发生,仅能产生少量能量;而当丙酮酸氧化生成乙酰CoA,参与三羧酸循环时,就能在线粒体中产生大量的能量[17]。OXPHOS的功能是实现细胞的能量转换,OXPHOS的过程是在各种酶的帮助下,从营养物质代谢过程中产生的NADH或FADH2中获取还原当量,并将其转移到O2中产生水[18]。MDH1是一种细胞质的苹果酸脱氢酶,主要催化草酰乙酸盐氢化还原为苹果酸盐,MDH1对OXPHOS是必不可少的,其表达水平与组织中的OXPHOS水平密切相关[19]。之前肝细胞损伤研究中发现,自噬水平的增加可以提高肝细胞内的MDH1水平[20]。本研究中,CAY10683处理后,可能由于自噬水平的提高,ALF小鼠肝组织中MDH1的含量增加,而MRT68921组小鼠MDH1含量则有所下降。一项神经系统疾病的研究指出,当OXPHOS不足以为神经元提供所需的ATP时,增加糖酵解将有助于缓解能量不足,维持神经元的紧急能量需求[21]。在本研究中,ALF模型小鼠中的OXPHOS效率下降,导致糖酵解的能量需求更大。与D-Gal/LPS组相比,用MRT68921处理的小鼠肝组织内有更高的葡萄糖含量,产生更多的丙酮酸,并且由于氧化能力不足,产生更多的乳酸,LDH的活性增加。

虽然糖酵解可以暂时提供一些能量,但最好的解决办法是恢复细胞的OXPHOS。OXPHOS系统位于线粒体中,线粒体被称为细胞的动力室,产生细胞所需的大部分能量和ATP[22]。线粒体自噬是保证线粒体质量的一个重要途径,其本质是一种选择性的自噬降解,可以清除功能失调和多余的线粒体以维持能量平衡[23]。当自噬水平提高时,线粒体的质量在一定意义上得到改善。线粒体的质量提升一定程度上可恢复OXPHOS,改善能量供应,实现了对受损肝脏的保护作用。在本研究中,与D-Gal/LPS组相比,用CAY10683处理增加了肝组织自噬水平,其葡萄糖含量更低,产生的丙酮酸更少,而且由于氧化效率更高,产生的乳酸更少,LDH的活性也下降了,而用自噬抑制剂MRT68921处理的组则相反,CAY10683拮抗了MRT68921的作用。

在本研究ALF小鼠模型中,HDAC2抑制剂CAY10683提高了肝组织内自噬蛋白ULK1水平和代谢酶MDH1水平,拮抗自噬抑制剂MRT68921的作用,改善了代谢环境,对肝脏起到了一定的保护作用。HDAC2抑制剂CAY10683可能可以通过增强组织内自噬水平,改善组织内代谢环境以提供更好的能量供应,从而对小鼠肝脏起到保护作用。HDAC2抑制剂的作用对ALF的治疗提供了一个可行的方向。