食管鳞癌组织中TIM-3、FOXA2表达与其临床病理特征及预后的关系研究

张 楠 程 多 王晶晶 胡 杨 岳文莉 白慧丽 梁 芳

食管癌为临床常见消化道恶性肿瘤之一,鳞状细胞癌为其主要组织学类型,约占食管癌患者86.3%,预后较差[1]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)在机体免疫抑制及周围免疫耐受中发挥重要作用,可选择性表达于恶性肿瘤组织内T细胞,经直接或免疫抑制功能参与肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移过程[2]。叉头框蛋白A2(FOXA2)是一种细胞转录因子,属于抑癌基因,参与细胞信号传导及代谢调节过程,在前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中呈低表达,且与肿瘤发生发展密切相关[3-4]。基于此,本研究选取87例食管鳞癌患者,拟检测食管鳞癌组织中TIM-3、FOXA2表达,并探讨其与食管鳞癌患者临床病理特征、预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年12月本院收治的87例食管鳞癌患者(食管鳞癌组)。纳入标准:①符合《食管癌规范化诊治指南》[5]中食管癌诊断标准,接受标准的食管癌根治术治疗,术后病理确诊为鳞状细胞癌;②术前未行放化疗或其他生物治疗;③对本研究知情同意,签署知情同意书。排除标准:①患有其他恶性肿瘤;②合并认知障碍、意识障碍或严重精神系统疾病;③近1年内有严重外伤史或出血史;④患有全身免疫系统疾病;⑤妊娠、哺乳期妇女;⑥研究期间因疾病之外其他原因死亡。另选取同期经胃镜活检诊断为慢性食管炎的50例患者(对照组),排除标准同食管鳞癌组。食管鳞癌组,男性56例,女性31例;年龄38～72岁,平均(60.21±5.48)岁;体质量指数(Body mass index,BMI)18.25～30.55 kg/m2,平均(23.81±2.84)kg/m2。对照组中,男性32例,女性18例;年龄35～74岁,平均(60.84±7.12)岁;BMI 18.32～30.45 kg/m2,平均(23.76±2.55)kg/m2。两组患者年龄、性别、BMI等基线资料均衡可比(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 TIM-3、FOXA2表达检测 食管鳞癌组术中切取食管鳞癌组织,对照组胃镜下留取食管组织。采用免疫组织化学染色法检测TIM-3、FOXA2表达:标本组织以石蜡包埋,切片,厚度4 μm,60 ℃烤箱烘烤2 h,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,加3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,PBS液冲洗。室温孵育10 min,PBS液冲洗3次,每次5 min。EDTA缓冲液高压热力修复抗原,20 min,PBS液冲洗3次,每次5 min。加兔抗人TIM-3(1∶300)、FOXA2(1∶800)一抗(英国Abcam公司),4 ℃孵育,过夜。加生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶1000,英国Abcam公司),37 ℃孵育,30 min。DAB显色,苏木精复染,切片脱水,中性树胶封片,以PBS液代替一抗作为阴性对照。由2名高级职称的病理科医师采用双盲法共同阅片,各切片在高倍镜(×400)下随机取10个视野,细胞内棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。按照阳性细胞数占同类细胞总数百分率、染色强度计分。阳性细胞率<10%计1分;10%～50%计2分;>50%计3分。染色强度为无着色计0分;淡黄色计1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分。两者得分相乘,>3分为TIM-3或FOXA2阳性表达,≤3分为阴性表达。

1.2.2 一般资料收集 收集入组食管鳞癌患者性别、年龄、体质量指数、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、病理分类、组织学分级、肿瘤分化程度、浸润深度及TIM-3、FOXA2表达等。

1.2.3 预后评估 食管鳞癌组术后均按照《食管癌规范化诊治指南》[5]给予规范化辅助治疗,术后随访至2022年1月,随访方式包括电话随访、微信随访、门诊随访及住院复查记录,主要了解患者一般情况、病情变化及预后。按照预后随访情况分为生存、死亡,其中生存为总体生存,包括有瘤生存和无瘤生存,死亡为因食管鳞癌复发、进展或相关并发症死亡。

1.3 观察指标

①比较两组TIM-3、FOXA2表达情况;②比较不同临床病理特征的食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达情况;③比较不同预后的食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达情况;④分析TIM-3、FOXA2表达与食管鳞癌预后的关系。

1.4 统计学分析

应用SPSS 20.0统计学软件分析。计数资料采用“例数,率”表示,以χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线,生存检验采用Log-rank检验;采用Cox比例风险回归模型分析食管鳞癌预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者TIM-3、FOXA2表达比较

食管鳞癌组TIM-3阳性表达率高于对照组,FOXA2阳性表达率低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者TIM-3、FOXA2表达情况对比(例,%)

2.2 不同临床病理特征食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达比较

不同TNM分期、有无淋巴结转移及不同浸润深度的食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同临床病理特征食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达对比(例,%)

2.3 不同预后食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达比较

食管鳞癌组87例患者均获得随访,无失访病例,随访时间21～48个月,中位随访时间38.5个月。生存68例(78.16%),死亡19例(21.84%)。食管鳞癌组死亡患者TIM-3阳性表达率高于生存患者,FOXA2阳性表达率低于生存患者(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后的食管鳞癌患者TIM-3、FOXA2表达对比(例,%)

2.4 TIM-3、FOXA2表达与食管鳞癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存曲线显示,TIM-3阴性表达患者总生存率较阳性表达患者高,Log-rank检验χ2=10.325,P<0.001。FOXA2阴性表达患者总生存率较阳性表达患者高,Log-rank检验χ2=12.845,P<0.001,见图1。

图1 TIM-3、FOXA2表达与食管鳞癌患者预后关系的Kaplan-Meier生存曲线

2.5 食管鳞癌预后的影响因素分析

Cox单因素回归分析显示,TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、TIM-3、FOXA2是影响食管鳞癌患者预后的危险因素(P<0.05)。进一步行Cox多因素分析显示,TNM分期、淋巴结转移、TIM-3、FOXA2是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4、表5。

表4 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox单因素回归分析

表5 食管鳞癌预后影响因素的Cox多因素回归分析

3 讨论

近年来,世界范围内食管鳞癌相对多发,严重威胁人们生命健康。受食管特殊解剖学特点影响,食管鳞癌患者更易出现纵膈淋巴结转移、远处转移,加上早期症状不典型,入院确诊时已处于中、晚期,丧失最佳治疗时机,预后较差[6]。而且,相较于其他恶性肿瘤,食管鳞癌分子靶向及免疫治疗研究较少。因此,临床深入分析食管鳞癌的分子层面发病机制,探寻有效分子生物学标志物,以指导早期诊断及预后评估,为后续治疗提供参考依据,具有重要意义。

本研究结果显示,食管鳞癌组TIM-3阳性表达率高于对照组,FOXA2阳性表达率低于对照组;相较于TNM分期Ⅰ～Ⅱ、无淋巴结转移、浸润深度T1～T2的食管鳞癌患者,TNM分期Ⅲ～Ⅳ、有淋巴结转移、浸润深度T3～T4患者TIM-3阳性表达率升高,FOXA2阳性表达率降低(P<0.05),说明食管鳞癌患者存在TIM-3、FOXA2表达异常,且与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度密切相关,这提示TIM-3、FOXA2可能在食管鳞癌发生、发展中发挥重要作用。目前认为[7],T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。TIM-3为TIM家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于免疫检查点分子,可促进肿瘤免疫逃逸、侵袭及转移。文献提出[8-9],TIM-3在非小细胞肺癌、肾细胞癌等肿瘤细胞中呈高表达,且与肿瘤浸润、转移密切相关。杨惠雲等[10]研究发现,食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织中TIM-3表达升高。郑雨佳等[11]研究也发现,食管癌患者肿瘤组织T细胞表面存在TIM-3高表达,与临床分期、淋巴结转移密切相关,与本研究结果相符。FOXA2是一种新型抑癌基因,参与维持细胞增殖及凋亡平衡过程[12]。研究提出[13],FOXA2表达缺失可增加肿瘤发生发展风险。段会娟等[14]研究还发现,FOXA2低表达与肺腺癌患者淋巴结转移、胸膜侵犯密切相关,FOXA2过表达可抑制肿瘤细胞侵袭。文献提出[15],食道癌及Barrett食管中FOXA3表达升高,经下凋FOXA3后发现FOXA2呈低表达,认为FOXA3可能经由调控FOXA2,参与食管癌肿瘤发生发展过程。

另外,本研究还发现,与食管鳞癌生存患者相比,死亡患者TIM-3阳性表达率升高,FOXA2阳性表达率降低;Cox多因素回归分析显示,TNM分期、淋巴结转移、TIM-3、FOXA2为食管鳞癌预后的独立影响因素(P<0.05),这提示除TNM分期、淋巴结转移外,TIM-3、FOXA2也是影响食管鳞癌患者预后的重要因素。刘凯等[16]研究也证实食管癌组织中TIM-3表达升高,还发现TIM-3高表达可能是影响患者预后的独立危险因素,与本研究结果相符。因此,建议在临床实践过程中,加强食管鳞癌患者肿瘤组织TIM-3、FOXA2表达检测,以指导治疗方案制定,改善预后。但本研究并未就TIM-3、FOXA2表达影响食管鳞癌患者预后的相关机制进行分析,今后仍需进一步深入探讨。

综上所述,食管鳞癌组织中存在TIM-3、FOXA2表达异常,且与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度及预后密切相关。本研究不足之处在于所选病例数较少,样本来源有限,均来自同一所医院,随访时间短,未深入评估远期预后,可能影响结果客观性,今后仍需扩大样本量及样本来源,延长随访时间,进行进一步调查研究。