TRAF4和Eg5在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

陈媛琳 罗 婷 彭子萍

卵巢癌是女性生殖道比较致命的恶性肿瘤,可发生在任何年龄段[1]。卵巢癌的发病比较隐匿,早期无明显的体征和症状,一经确诊就被诊断为癌症晚期,其中有65%以上的患者确诊时已为Ⅲ期或Ⅳ期,癌灶已经在腹腔内弥散转移,而且晚期卵巢癌患者的5年生存率只为20%[2],预后较差,是威胁女性健康的主要肿瘤。TRAF4属于肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)家族的一员,是一类重要的胞浆衔接蛋白[3]。TRAF4早期在乳腺癌的转移淋巴结中被发现,后发现在多种肿瘤组织中高表达,能够促进肿瘤的发生和发展,在肿瘤细胞的生物学行为中发挥着至关重要的作用[4]。Eg5 是驱蛋白家族 kinesin-5之一,相关研究表明,Eg5也在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的发生和预后关系密切[5]。目前,尚未发现关于TRAF4和Eg5在卵巢癌中的相关报道,因此本研究探讨TRAF4和Eg5在卵巢癌中的表达以及与临床病理特征和预后的相关性,为卵巢癌的早期诊断和预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2017年5月至2020年6月本院收治的行手术治疗的卵巢癌患者术后石蜡包埋组织标本65例。纳入标准:有完整的临床资料;均经过病理学诊断为卵巢癌患者;术前均未进行放疗、化疗、免疫治疗等;均为原发性肿瘤,并为首次手术治疗。排除标准:合并心脑血管疾病以及其他恶性肿瘤的患者;卵巢癌转移的患者;合并急慢性疾病感染和免疫性疾病的患者;存在认知障碍和精神疾病的患者。并选取同期入本院接受手术治疗的卵巢上皮性良性病变肿瘤组织36例和因子宫肌瘤行全子宫及附件切除术的正常卵巢组织36例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 将石蜡标本切成厚度为4 μm的切片,烤片、脱蜡、水化和柠檬酸抗原修复,并加入100 μl的H2O2液,静止15 min后,采用PBS冲洗后,滴加50 μl的TRAF4和Eg5抗体(福州迈新生物技术开发有限公司),恒温放置24 h,取出切片,PBS冲洗,二抗和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液温孵育30 min,PBS冲洗,二氨基联苯胺显色,苏木精复染,脱水、透明及封片,放置在镜下观察。每张切片由2名病理学家进行独立评估对阳性细胞占比和染色强度进行评分,阳性细胞占比:0%为0分,1%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,76%～100%为4分;染色强度:无着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,阳性细胞占比和染色强度相乘分数≥ 4分为阳性表达。

1.2.2 实时荧光定量PCR法 将石蜡标本烤片、脱蜡,加入1 ml Trizol提取总RNA,用紫外分光光度仪测定RNA浓度,使用逆转录试剂盒(南京迈克沃德生物科技有限公司)将RNA逆转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR反应,TRAF4正向引物序列为5'-TTCACTCT GCTATCTTCATCTGC-3'; 反向引物序列为5'-ATATCGCGCCGCTGTCGCTGCT-3';Eg5正向引物序列为5'-AAATCTTGCCTCCGAGGTG-3'; 反向引物序列为5'-TGGTGCG GTAGATGTCG-3'; PCR总反应体系为20 μl,PCR反应条件:95 ℃,15 min,起始模板变性,95 ℃,10 s,PCR循环模板变性,58 ℃,30 s,退火,72 ℃,30 s,延伸,40个循环。用2-△△Ct法计算TRAF4和Eg5 mRNA相应的数值。TRAF4以1.36为截断值进行分组,>1.365为TRAF4高表达组(n=34),≤1.36为TRAF4低表达组(n=31);Eg5以1.48为截断值进行分组,>1.48为Eg5高表达组(n=35),≤1.48为Eg5低表达组(n=30)。

1.2.3 随访 以电话或者门诊的形式进行随访,随访的截至日期为2022年7月,计算术后5年总生存率和生存时间,并进行记录。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 TRAF4和Eg5在卵巢癌组织中的阳性表达

卵巢癌组织中TRAF4和Eg5的阳性表达率明显高于良性病变组织和正常卵巢组织(P<0.001),良性病变组织中TRAF4和Eg5的阳性表达率明显高于正常卵巢组织(P<0.001),见表1。

表1 卵巢癌、良性肿瘤及正常卵巢组织中TRAF4和Eg5的表达比较(例,%)

2.2 TRAF4和Eg5 mRNA在各组织中的表达

卵巢癌组织中TRAF4和Eg5 mRNA表达率明显高于良性病变组织和正常卵巢组织(P<0.001),良性病变组织中TRAF4和Eg5mRNA表达率明显高于正常卵巢组织(P<0.001),见表2。

表2 卵巢癌、良性肿瘤及正常卵巢组织中TRAF4和Eg5mRNA的表达比较

2.3 TRAF4和Eg5 mRNA水平与卵巢癌临床病理特征的相关性

不同年龄、组织学类型、肿瘤大小、分化程度的TRAF4和Eg5 mRNA水平对比,差异均无统计学意义(P均>0.05),有淋巴结转移者TRAF4和Eg5 mRNA水平明显高于无淋巴结转移者(P<0.001),FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期的TRAF4和Eg5 mRNA水平明显高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.001),浸润程度T3～T4期TRAF4和Eg5 mRNA水平显著高于T1～T2期(P<0.001),见表3。

表3 TRAF4和Eg5 mRNA水平与卵巢癌临床病理特征的关系

2.4 TRAF4与Eg5表达的相关性

Person相关性分析结果显示,TRAF4与Eg5表达水平呈正相关性(γ=0.326,P<0.001)。

2.5 TRAF4和Eg5对卵巢癌早期诊断效能

绘制TRAF4和Eg5检测的ROC曲线用于卵巢癌的早期诊断,结果显示,TRAF4的ROC曲线面积为0.837(95%CI:0.765～0.908,P<0.001),截断值为1.36时,灵敏度为73.85%,特异度为81.54%;Eg5的ROC曲线面积为0.913(95%CI:0.864～0.961,P<0.001),截断值为1.48时,灵敏度为87.69%,特异度为81.54%,见图1。

2.6 TRAF4和Eg5 mRNA对卵巢癌预后的影响

本组病例共随访25～60个月,中位随访时间为49个月,总生存率为56.92%。Kaplan-Meier曲线分析显示,TRAF4高表达组患者5年总生存率为47.06%,明显低于TRAF4低表达组患者(67.74%),差异具有统计学意义(P<0.05);Eg5高表达组患者5年总生存率为42.86%,明显低于Eg5低表达组患者(73.33%),差异具有统计学意义(P<0.05),见图2。

图2 不同TRAF4和Eg5 mRNA水平卵巢癌患者的生存曲线

3 讨论

卵巢癌发病率约占女性全身恶性肿瘤的4%,发病率列居第三位,仅次于宫颈癌和宫体癌[6]。另外该病的死亡率也比较高,据不完全统计报道,卵巢癌占全球女性死亡数的4.7%,对女性的生命造成了严重的威胁[7]。由于卵巢癌解剖位置处于盆腔的深部,与其他的妇科恶性肿瘤相比,卵巢癌早期症状难以发现,而且恶性程度较高,进展快,一经诊断大部分患者已经为临床晚期,已扩散到子宫双侧附件,大网膜及盆腔各器官,经过治疗后复发率较高。因此,寻找新的潜在有效的靶向基因及生物标志物是卵巢癌诊断和治疗的关键。

TRAF蛋白属于细胞质调节蛋白家族中的一种,在免疫系统中发挥主要作用[8]。在免疫系统中,TRAF蛋白可调节细胞内NF-kB或者AP-1等信号通路,并激活部分转录因子[9]。另外,TRAF4也表达于乳腺癌及转移病灶的上皮细胞,参与多种信号通路调控和参与细胞的增殖、侵袭和乳腺癌的转移[10]。TRAF4定位于细胞核,可能是一种转录因子。相关研究发现,TRAF4在肺炎症反应和前列腺癌等癌组织中异常表达[11]。但在卵巢癌中的相关报道较少。本研究结果发现,卵巢癌组织中TRAF4阳性表达率和TRAF4 mRNA明显高于良性病变组织和正常卵巢组织,有淋巴结转移的组织中TRAF4 mRNA水平明显高于无淋巴结转移的组织,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中TRAF4 mRNA水平明显高于Ⅲ～Ⅳ期,浸润度T3-T4期中TRAF4 mRNA水平显著高于T1-T2期;且对卵巢癌的诊断价值较高,TRAF4高表达组患者的5 年总生存率明显低于TRAF4低表达组。相关研究表明,TRAF4的基因扩增是TRAF4蛋白在人类肿瘤中高表达的因素之一[12]。从而推断TRAF4可能在癌症中的诊断和预后都具有至关重要的作用。

Eg5是一种有丝分裂驱动蛋白,属驱动蛋白家族成员之一[13]。Eg5基因定位于10q24,E95基因的缺失、突变或者Eg5蛋白的过表达和多种癌症的发生发展、转移、浸润、复发和预后具有一定的相关性[14]。近年来大量的研究发现,Eg5 mRNA的高表达存在于肺癌、直肠癌、乳腺癌和宫颈癌中,这可能与Eg5促进细胞的异常增殖相关[15]。本研究结果发现,卵巢癌组织中Eg5阳性表达率和 Eg5 mRNA明显高于良性病变组织和正常卵巢组织,有淋巴结转移的组织中Eg5 mRNA水平明显高于无淋巴结转移的组织,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中Eg5 mRNA水平明显高于Ⅲ～Ⅳ期,浸润度T3-T4期中Eg5 mRNA水平显著高于T1-T2期;且对卵巢癌的诊断价值较高,Eg5高表达组患者的5 年总生存率明显低于Eg5低表达组,说明Eg5也在卵巢癌的诊断和预后中也起着至关重要的作用。相关研究表明,Eg5蛋白在肺癌组织中呈阳性表达;Eg5蛋白高表达与淋巴结转移密切相关,Eg5阳性提示肺癌患者预后不良。也有研究表明,Eg5在非小细胞肺癌中高表达,高表达与非小细胞肺癌临床分期及转移有关,Eg5可预测非小细胞肺癌的淋巴结转移情况,与本研究结果类似。相关研究通过质谱分析实验检测TRAF4可能存在相互作用的待选蛋白,其中包括有丝分裂相关蛋白Eg5[16]。TRAF4在细胞有丝分裂期的表达量高于分裂间期,且在有丝分裂前、中、后、末期均与 Eg5 共定位,干扰 TRAF4的表达,Eg5 蛋白的表达量会降低[17]。本研究进一步通过Person相关性分析验证了TRAF4和Eg5的相关性,结果表明,TRAF4和Eg5水平呈正相关。但有关TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌中的相关机制需要进一步验证。

综上所述,TRAF4和Eg5在卵巢癌中高表达,与淋巴结转移、FIGO 分期和浸润程度相关,检测TRAF4和Eg5的表达对于卵巢癌的早期诊断和预后具有一定的诊断价值,有望成为卵巢癌新型药物治疗的靶点。本研究存在一定的不足,关于TRAF4和Eg5相互作用机制未在本研究中进行报道,所以在后续实验中继续验证TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌发展中的相关机制。