RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌组织中的表达及与其预后相关性

倪健彬 王 颖

随着医学进步及对乳腺癌的深入研究,目前已形成局部治疗与全身治疗并重治疗模式[1]。多环节作用机制的分析靶向治疗已成为近年最活跃研究领域之一,多项研究表明癌细胞内某些基因或的表达与疾病发生、发展及预后密切相关[2-3]。最新文献认为RNA XIST、mir-130b-3p在多种恶性肿瘤细胞中均有表达,mir-130b-3p可抑制乳腺上皮细胞正常分化、增殖、细胞间信号转导、及细胞间粘附等过程,RNA XIST可促进肿瘤生长、侵袭及转移[4],提示RNA XIST、mir-130b-3p可能对乳腺癌患者疾病转归及短期生存率影响较大。本文将研究RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌细胞中的表达及相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

经医院医学伦理会讨论通过,选取2014年1月至2016年1月于我院收治并确诊的120例乳腺癌患者,收集患者癌组织和癌旁正常组织。入选标准:①符合中国抗癌协会提出乳腺癌诊断标准[5];②女性;③年龄18～90岁;④未接受过治疗;⑤预计存活期超过1年。排除标准:①恶性肿瘤;②依从性差,不能定期随访;③乳腺癌既往史;④合并精神疾病。剔除标准:①中途自愿退出;②未完成或进行其他治疗;③随访资料不完整。其中年龄35～80岁,<55岁78例,≥55岁42例;BMI<18.5 kg/m259例、≥18.5 kg/m261例;平均KPS评分(80.65±2.11)分、70～80分50例、>80分70例;肿瘤直径≤5 cm 56例,>5 cm 64例;Ⅰ～Ⅱ期54例、Ⅲ～Ⅳ期66例;有淋巴结转移68例,无淋巴结转移52例;低分化44例,高中分化76例。

1.2 方法

10%甲醛溶液(北京诺博莱德)固定乳腺癌组织和癌旁正常组织,经梯度浓度酒精(苏州吉玛基因股份有限公司)脱水后包埋成块(山东佰仟化工包埋机);将组织切成5 μm的连续切片(深圳市汇沃科技切片机),依次采用二甲苯(桂林漓峰医药用品)、柠檬酸钠(北京维欣仪奥科技)及3%过氧化氢(山东佰仟化工)进行脱蜡、修复及阻断;PBS缓冲液(上海恒远生物科技)漂洗3次后加山羊血清(上海田源生物技术)封闭,滴加经稀释的鼠抗人mir-130b-3p多克隆抗体、鼠抗人RNA XIST单克隆抗体(上海立瑶生物);PBS漂洗3次后加入羊抗鼠IgG(四川讯麦科技)25 ℃孵育30 min漂洗;使用DAB显色试剂盒(Solarlaio)显色,苏木精(上海长哲生物科技)复染、梯度酒精脱水及中性树脂(南京森贝伽生物科技)封片,显微镜下观察RNA XIST、mir-130b-3p表达。

判定标准。染色强度:0分为不着色,1分为淡黄色,2分为深黄色,3分为棕黄色;阳性细胞百分率:0分为0～5%,1分为5%～25%,2分为26%～50%,3分为51%～75%,4分为>75%。两项之和≤ 3分为阴性,>3分为阳性[3]。

1.3 随访方式

采用电话及复查方式进行随访,纳入本研究后第1年,每3个月随访1次,第2年开始每6个月随访1次,随访至患者死亡或60个月止。随访期间无人失访。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌组织和癌旁组织中表达水平比较

RNA XIST主要定位于细胞质中,呈黄色或棕黄色颗粒;RNA XIST在乳腺癌组织中表达量较高(P<0.05);mir-130b-3p主要定位于细胞核中,呈黄色或棕黄色颗粒;mir-130b-3p在乳腺癌组织中的表达量较低(P<0.05),见表1。

表1 mir-130b-3p、RNA XIST在乳腺癌和癌旁组织中表达量

2.2 RNA XIST、mir-130b-3p表达相关性

RNA XIST与mir-130b-3p表达呈显著负相关关系(γ=-0.277,P=0.002,图1)。

图1 RNA XIST与mir-130b-3p表达相关性

2.3 RNA XIST、mir-130b-3p表达量与其临床病理特征的关系

RNA XIST、mir-130b-3p表达量与患者年龄、肿瘤直径、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度呈显著相关关系(P<0.05),RNA XIST、mir-130b-3p表达量与BMI、KPS评分不相关(P>0.05)(表2)。

表2 RNA XIST、mir-130b-3p表达量与其临床病理特征的关系

2.4 随访结果

所有患者均从治疗起随访60个月,6例于治疗后24～36个月复发,8例全身转移,54例死亡(12～18个月死亡4例,18～24个月死亡3例,24～30个月死亡4例,30～36个月死亡7例,36～42个月死亡8例,42～48个月死亡9例,48～54个月死亡9例,54～60个月死亡10例)。结果存活患者RNA XIST表达量低于死亡患者(P<0.05)、mir-130b-3p表达量高于死亡患者(P<0.05),见表3和图2。

图2 总生存率图

表3 RNA XIST、mir-130b-3p表达量比较

2.5 乳腺癌患者死亡危险因素Logistic回归分析

应用独立因子(年龄、BMI、KPS评分、肿瘤直径、肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及RNA XIST、mir-130b-3p表达量)建立Logistic回归模型,以>0.5时预报为恶性,≤0.5时预报为良性,结果显示建立该模型准确率90.11%,提示预报准确性较高。此时,RNA XIST表达量最佳截断值为7.23,>7.23 提示高表达,≤7.23 提示低表达;mir-130b-3p表达量最佳截断值为6.15,>6.15 提示高表达,≤6.15 提示低表达。进一步将乳腺癌患者死亡作为因变量,有预测意义的因子作为自变量,分析发现,年龄≥55岁、肿瘤直径>5 cm、肿瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、RNA XIST高表达、mir-130b-3p低表达为乳腺癌患者死亡危险因素(P<0.05),见表4,表5。

表4 赋值表

表5 危险因素Logistic回归分析

3 讨论

肿瘤转移、复发是乳腺癌患者死亡主要原因[6]。参考国内外研究得出,癌细胞转移是一个多因素、多步骤、多阶段发展过程,涉及基因改变[7-8]。目前国际上指出乳腺癌致病相关基因较多,抑癌基因和促癌基因在不同组织中扮演着不同角色,其中较敏感的分子主要有微小RNA(MicroRNA, miRNAs)[9-10]。这一理论也提示基因的表达存在组织和个体特异性,可能对肿瘤最终发生、发展有着一定差异。

mir-130b-3p是miRNAs中一类调控基因表达的小RNA分子,在正常细胞中呈高表达水平[11-12]。相关研究证实,细胞一旦发生癌变或浸润,mir-130b-3p表达量可异常下降,考虑其对乳腺癌病情发展和预后有较高价值[13]。目前已在动植物及病毒中发现大量RNA XIST,这些分子可促进癌细胞增殖、分化过程[14]。关于RNA XIST的较多报道是其可参与女性X染色体失活和男性X染色体调节,在基因突变型疾病中表现为异常上调[15]。且多项研究发现,RNA XIST在肺癌、结直肠癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中均有表达,考虑其异常上调对肿瘤繁殖与分化有促进作用[16-17]。本研究分析乳腺癌组织和癌旁正常组织中RNA XIST和mir-130b-3p的表达量发现,乳腺癌组织中RNA XIST呈高表达而mir-130b-3p呈低表达。已有研究报道,mir-130b-3p在乳腺癌中表达水平低于健康者,而相关性分析中发现其表达水平与病情进展呈显著负相关[18],这与本研究结果一致。另外,有报道称膀胱癌患者中检测到大量RNA XIST,且晚期膀胱癌RNA XIST表达量显著高于早期患者,提示其与癌细胞增殖呈显著正相关关系[19]。相关性分析提示,RNA XIST与mir-130b-3p呈负相关,也说明两者拮抗作用。

为进一步探讨RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌细胞中的作用,本研究继续分析了其与临床病理特征及5年生存率的关系,发现RNA XIST、mir-130b-3p可影响乳腺癌疾病进展和总生存率。当RNA XIST呈高表达时,患者年龄、肿瘤直径较小,而这与临床一直以来认为年龄可影响化疗效果契合,由于老年患者身体机能、免疫功能等各方面均处于低水平状态,化疗对自身影响较大而影响短期生存率[20-21]。本研究年龄≥55岁、肿瘤直径>5 cm是影响乳腺癌患者预后高危因素,也进一步说明高水平的RNA XIST可降低生存率。另mir-130b-3p呈高表达时,肿瘤稳定性较好,主要表现为肿瘤分期早、无淋巴结转移,而肿瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移为乳腺癌患者死亡危险因素,提示mir-130b-3p水平越高,疾病转归能力和预后越好。本研究生存率>5年患者RNA XIST表达量低于生存率<5年患者,mir-130b-3p表达量高于生存率<5年患者,说明RNA XIST可促进癌细胞增殖和分化、mir-130b-3p可促进癌细胞凋亡。

综上,RNA XIST在乳腺癌细胞中呈高表达,mir-130b-3p在乳腺癌细胞中呈低表达,均与乳腺癌临床病理特征和预后密切相关,提示应注意关注RNA XIST、mir-130b-3p表达量。但本研究研究时间较短、纳入病例数较少,其具体机制尚不清楚,有待扩大样本并针对其具体机制作进一步研究。