多发性骨髓瘤组织中miR-29c、miR-195表达水平变化及其与临床病理特征及预后的关系

石瑞平 陈兴华 李 真

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种恶性浆细胞病,其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞,而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞[1]。骨髓中恶性浆细胞发生过度克隆增殖,伴随有单克隆免疫球蛋白,或者是轻链过度生成,导致患者正常的造血功能受到抑制,从而出现多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害等一系列的临床表现[2-3]。近年来随着免疫调节药物以及蛋白酶抑制剂的广泛使用,MM患者的预后已有所改善,但仍有部分患者出现耐药性及多种并发症,严重者可导致患者死亡[4]。因此,寻找更有效、可靠的分子标志物进行个体化分型以指导临床精准治疗对改善MM患者临床病理特征及预后意义重大。微小RNA(miRNA)是一类长度在12～21个核苷酸之间的内源性非编码RNA,具有调节基因表达功能,参与细胞增殖、分化及凋亡等过程,其在造血干细胞自我更新、衰老及向恶性肝细胞转变等过程中参与调控细胞信号传导途径及表观遗传机制[5]。研究发现,miRNAs的表达水平与肿瘤的发生发展有关,可能参与MM疾病的发生发展,并发挥致癌及抑癌作用[5]。越来越多的研究证实,miRNAs在MM中的异常表达与患者耐药性、肿瘤复发、造血微环境、并发症发生等密切相关,miRNAs有望成为MM患者早期诊断、预测预后的分子标志物[6]。因此,本研究通过检测MM患者骨髓组织中miR-29c、miR-195表达水平,分析其与患者临床病理特征及预后的关系,旨在探讨miR-29c、miR-195在MM进展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年12月至2020年6月在本院就诊的MM患者75例作为病例组,另选取同期就诊的75例骨髓象检查为正常的非血液系统疾病患者作为对照组。病例组男性45例,女性30例;年龄35～75岁,平均(57.82±4.78)岁;对照组男性42例,女性33例;年龄34～78岁,平均(48.14±4.2)岁。2组年龄、性别比较无显著差异(P>0.05),具有可比性。

纳入标准:MM患者均符合2003年国际骨髓瘤工作组制定的MM诊断标准[7];临床资料完整;患者及家属均签署本研究知情同意书。

排除标准:合并感染性疾病,合并其他血液系统疾病,如溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜等;曾有骨髓穿透史者;合并其他恶性肿瘤者,如宫颈癌、子宫肌瘤等;妊娠及哺乳期者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法及随访 MM患者均给予以硼替佐米为基础的联合化疗,BAD方案(硼替佐米、多柔比星、地塞米松),BADT方案(硼替佐米、多柔比星、地塞米松、沙利度胺),维持治疗方案为沙利度胺。自患者出院之日开始进行随访2年,截止至2022年6月,1次/月,若患者发生死亡事件则随访结束。

1.2.2 骨髓组织miR-29c、miR-195表达水平检测 分别于患者入院第2天无菌采集骨髓细胞2 ml,置于肝素抗凝管中,按照Trizol试剂盒说明书进行操作,提取骨髓组织总RNA,将其溶于20 μl DEPC水;按照反转录试剂盒说明书进行逆转录,反应体系:M-MLV,Olig(dT)及dNTPs各1 μl,0.5 μl RNA酶抑制剂,H2O补足至15 μl。以cDNA为模板进行qPCR扩增,反应体系:缓冲液2.5 μl,dNTPs、上下游引物各1 μl,Taq DNA 0.5 μl,ddH2O补足至25 μl,反应程序:94 ℃ 1 min,94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s,40个循环。以U6为内参,采用2-△△Ct法计算miR-29c、miR-195相对表达量。miR-29c上游引物序列:CTCGAGCTGTGGTCCTCTTAGCCAG;下游引物序列:GAATTCGACTCCTAGCAGCCATCACC;miR-195上游引物序列:CCTAGCAGCACAGAAA;下游引物序列:GAGCAGGGTCCGAGT;U6上游引物序列:CTCGCTTCGGCAGCACA,下游引物序列:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.3 血清因子检测 抽取受试者空腹静脉血5 ml,离心获取血清,采用酶联免疫吸附法检测血清血红蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶、肌酐、钙、β2微球蛋白及白蛋白水平,操作步骤严格按照说明书进行,试剂盒由上海恒远生物科技有限公司。

1.2.4 分组 根据miR-29c、miR-195检测水平的平均值将MM患者分为高水平组和低水平组。

1.3 观察指标

(1)比较病例组与对照组的骨髓组织miR-29c、miR-195表达水平;(2)比较MM患者miR-29c高水平组和低水平组的临床病理特征;(3)比较MM患者miR-195高水平组和低水平组的临床病理特征;(4)分析miR-29c、miR-195与预后的关系,随访2年,统计MM患者出院后的生存时间;(5)分析miR-29c、miR-195与病理特征及预后的相关性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 比较病例组与对照组骨髓组织中miR-29c、miR-195表达水平

病例组组织miR-29c、miR-195表达水平低于对照组(P<0.05),见表1。

表1 病例组与对照组骨髓瘤组织中miR-29c、miR-195表达水平

2.2 比较miR-29c、miR-195高水平组和低水平组的临床病理特征

2组年龄、性别、免疫分型以及血清血红蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶、肌酐、钙及β2微球蛋白水平比较无显著差异(P>0.05),miR-29c、miR-195低水平组中ISS分期Ⅲ期及血清白蛋白水平<35 g/L的患者占比高于各自高水平组(P<0.05),见表2。

表2 miR-29c、miR-195高水平组和低水平组的临床病理特征对比(例 ,%)

2.3 比较miR-29c、miR-195高水平组和低水平组的预后情况

miR-29c低水平组的生存期低于高水平组(P<0.05),miR-195低水平组的生存期低于高水平组(P<0.05),见表3。

表3 miR-29c、miR-195高水平组和低水平组生存期比较

2.4 miR-29c、miR-195表达水平与临床病理特征及预后的相关性

组织miR-29c、miR-195表达水平与ISS分期呈负相关(P<0.05),与血清白蛋白水平、生存期呈正相关(P<0.05),见表4。

表4 miR-29c、miR-195表达水平与临床病理特征及预后的相关性

3 讨论

MM是分泌产生M蛋白的浆细胞恶性增殖性疾病,MM细胞无限增殖,导致患者出现肾损伤、神经症状、贫血等症状[8]。近年来,MM的发病率逐年递增,发病人数已高达12万人,约占血液系统恶性肿瘤的12%,严重威胁人们身心健康[9]。目前,临床常采用免疫调节因子、自体造血干细胞移植、化疗等方式治疗MM,虽然能够在一定程度上延长患者生存时间,但无法彻底治愈,且预后较差[10]。分子学研究发现,miRNA具有多种生物学调控功能,能够影响浆细胞的分化、增殖、凋亡等生物学过程,在MM的发生发展中发挥重要作用,是MM进展的重要调控分子[11]。

miR-29c是miR-29家族成员之一,作为抑癌基因,参与了细胞分化、凋亡、增殖多种生物学过程,影响多种恶性肿瘤的发生、发展及预后[12]。有研究发现,miR-29c是骨髓分化的调控因子,在多种血液系统疾病中发挥抑制肿瘤生长的作用[13]。miR-195是miR-15家族成员之一,与家族成员miR-497具有高度同源性,在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤组织中异常表达,能够通过抑制调控miRNA活性诱导恶性肿瘤细胞凋亡、分化[14]。有研究显示,部分预后较差的卵巢癌患者存在17号染色体缺失现象,而miR-195基因定位于17号染色体[15]。本研究结果显示,MM患者骨髓组织中miR-29c及miR-195均低表达,MM患者ISS Ⅲ期患者组织中miR-29c及miR-195低表达率均高于ISS Ⅰ、Ⅱ期患者,MM患者骨髓组织中miR-29c、miR-195表达下调可能与MM发生、发展密切相关。

研究发现,miR-29c在卵巢癌组织中表达下调,其可通过激活PI3K/AKT信号通路调控肿瘤细胞的恶性增殖行为,进而参与宫颈癌的发生发展过程[16]。另有研究表明,miR-29c在乳腺癌组织中表达下调,能够通过与DNMT3A3'端非编码区结合抑制DNMT3A的表达,进而抑制乳腺癌细胞的生长[17]。miR-195表达下调可促进促癌基因S6K1的表达,提高癌细胞的生物学活性,促进卵巢癌疾病的发生发展[18]。在胃癌中,miR-195表达下调能够促进肿瘤细胞生长因子及肿瘤血管生成因子的生成,侵袭MMP3因子,导致结肠癌细胞增殖、分化及转移,进一步使病情恶化[19]。另有研究发现,miR-195能够通过抑制CDK6、E2F3、细胞周期蛋白D1的信号抑制肝癌细胞的G1/S的转换,从而抑制肝癌细胞的增殖[20]。本研究进一步分析发现,miR-29c低水平组及miR-195低水平组平均生存时间明显短于高水平组,提示组织miR-29c及miR-195水平能够作为临床判断MM患者生存预后的标志物分子。研究发现,miR-195在胆管癌患者中表达下调与其患者术后生存期具有关联性,可作为临床评估宫颈癌患者病情和预测预后的生物学分子指标[21]。另外孙生安等研究显示,miR-29c在胃癌组织中表达下调,参与胃癌的发生发展过程,且与患者临床病理特征和预后密切相关,可作为胃癌诊断及预测预后的标志物[22]。结合本研究结果,miR-29c、miR-195可能参与MM疾病的发生发展,其水平变化与患者病理特征及预后密切相关,有望成为临床治疗MM的新靶点。

综上所述,MM患者骨髓组织miR-29c、miR-195水平降低,其表达变化与血清白蛋白水平及ISS分期有关,miR-29c及miR-195低表达的MM患者预后较差。因此,组织miR-29c及miR-195水平可作为临床评估MM预后的指标。