芍药苷调节丝氨酸/苏氨酸激酶/鼠双微基因2/p53信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响实验研究

许卫星,张 薇,陈姣敏,尹凤雷,王 娟

(沧州市中心医院血液内一科,河北 沧州 061001)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的病理类型,约占所有确诊非霍奇金淋巴瘤病例的30%～40%,具有很大的异质性,呈弥漫性生长[1-2]。DLBCL的主要治疗方案是利妥昔单抗加环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松,大约40%～50%患者通过该方法可治愈[3],但由于超过一半的患者出现化疗耐药、复发和转移,DLBCL患者的5年生存率非常低[4],因此研究新的药物对于DLBCL患者的治疗非常重要。芍药苷(Paeoniflorin,PAE)从白芍中获得,具有预防低血压综合征、预防惊厥以及免疫调节等多种功能,还被证明在多种人类恶性肿瘤中具有抗癌活性[5],但其在DLBCL中的研究鲜有报道。丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine/threonine kinase,AKT)信号通路是经典的细胞内信号通路,可抑制细胞凋亡,调节糖原代谢,通过一系列机制参与许多不同类型肿瘤的发展,如AKT/鼠双微基因2(Murine double minute 2,MDM2)/p53信号通路在细胞凋亡和增殖的调节中起重要作用[6]。已有研究[7]显示,抑制MDM2/p53信号通路可以抑制DLBCL的发展。本研究研究探讨PAE通过调节AKT/MDM2/p53信号通路对DLBCL细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 DLBCL细胞株OCI-LY3细胞由吉雅生物技术研究所提供,在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养,在37 ℃、5% CO2的潮湿空气中孵育,当细胞融合度达到80%～90%时进行实验。

1.2 主要试剂与仪器 Gibco提供RPMI-1640培养基(批号:A1049105);GIBCO提供青霉素-链霉素(批号:15140-122);Excell Bio提供胎牛血清(批号:FCS500);西安开米生物工程有限公司提供PAE(批号:K120505);南京恩晶生物科技有限公司提供CCK-8试剂盒(批号:E1CK-000208)、RIPA裂解液(批号:E1WP106)、SDS-PAGE变性蛋白上样缓冲液(批号:E1WP303);上海碧云天生物技术有限公司提供BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号:P10010);Abcam公司提供AKT激活剂SC79(批号:ab146428)、p-AKT(批号:ab8933)、p-MDM2(批号:ab16895)、AKT(批号:ab8805)、MDM2(批号:ab22710)、p53(批号:ab26)单克隆抗体;BD Biosciences公司提供Annexin V-FITC/碘化丙锭(PI)双染试剂盒(批号:559763)。Thermo Fisher Scientific提供Multiskan MK3酶标仪;BD BioScience提供BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪;Thermo公司提供HERAcell 150i CO2培养箱;南京麦高德生物科技有限公司提供Tanon VE-180B转膜仪。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组及处理[8-9]:OCI-LY3细胞分别经15、30、60 μmol/L PAE处理,标记为PAE低浓度组、PAE中浓度组和PAE高浓度组;并设置在60 μmol/L PAE进行处理前,以8 μg/ml SC79孵育细胞24 h,标记为PAE高浓度+SC79组;同时以未经处理的细胞为对照组。各组处理48 h后进行指标分析。

1.3.2 CCK-8法检测细胞增殖:取OCI-LY3细胞(1×103个/孔)接种到96孔板中,置于37 ℃湿润培养箱中,按照上述分组处理后向每个孔中加入10 μl CCK-8试剂,并在37 ℃孵育2 h。最后使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值,分析细胞增殖。

1.3.3 平板克隆形成实验分析细胞克隆形成能力:将OCI-LY3细胞接种到6孔板中,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于培养箱中培养14 d,每3天更换1次培养基,之后经4%多聚甲醛固定、结晶紫染色,在室温下孵育30 min,用去离子水洗去多余的染料,进行克隆形成计数。

1.3.4 流式细胞术分析细胞周期:收集OCI-LY3细胞,用PBS洗涤,固定在预冷的75%乙醇中,并在20 ℃下储存过夜。用PBS洗涤后,用PI在室温下染色15 min,通过流式细胞仪分析细胞周期变化。

1.3.5 Annexin V/PI双染法分析细胞凋亡:将PBS洗涤的细胞悬浮在100 μl FITC结合缓冲液中,最低浓度为1×106个/ml,在4 ℃下与5 μl膜联蛋白V/FITC结合15 min。然后加入10 μl PI在室温下黑暗中孵育30 min,流式细胞仪及FlowJo软件分析凋亡细胞变化。

1.3.6 Western blot检测p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53蛋白水平:从OCI-LY3细胞中提取蛋白质,经SDS-PAGE电泳后转移到聚偏氟乙烯膜上。然后用5%脱脂牛奶封闭膜1 h,并在4 ℃下与p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53一抗一起孵育过夜。用Tris缓冲溶液洗涤膜3次后,室温下将辣根过氧化物酶偶联二抗与膜孵育1 h,使用增强化学发光试剂盒检测免疫反应性蛋白条带,以单克隆GAPDH抗体为对照,使用图像分析程序定量分析条带。

2 结 果

2.1 PAE对OCI-LY3细胞增殖的影响 与对照组(100.00±0.00)比较,细胞增殖率在PAE低浓度组(75.28±7.56)、PAE中浓度组(52.38±5.26)、PAE高浓度组(32.55±3.27)中降低(q=11.973、23.064、32.668,均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组细胞增殖率(56.77±5.69)增加(q=11.731,P<0.05)。

2.2 PAE对OCI-LY3细胞克隆形成能力的影响 见图1。对照组、PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组和PAE高浓度+SC79组细胞克隆形成数依次为(176.52±17.68)个、(123.34±12.36)个、(86.34±8.77)个、(42.22±4.26)个和(87.61±8.81)个。与对照组比较,PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组细胞克隆形成数降低(q=11.532、19.555、29.122,均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组细胞克隆形成数增加(q=9.842,P<0.05)。

图1 各组细胞克隆形成数变化(结晶紫染色)

2.3 PAE对OCI-LY3细胞周期的影响 见表1。与对照组比较,PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组G0/G1期增加,G2/M、S期降低(均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组G0/G1期降低,G2/M、S期增加(P<0.05)。

表1 各组OCI-LY3细胞周期比较(%)

2.4 PAE对OCI-LY3细胞凋亡的影响 见图2。对照组、PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组和PAE高浓度+SC79组细胞凋亡率依次为(6.82±0.70)%、(13.55±1.36)%、(27.88±2.88)%、(39.88±4.02)%和(26.75±2.71)%。与对照组比较,细胞凋亡率在PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组增加(q=6.301、19.742、30.991,均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组细胞凋亡率降低(q=12.308,P<0.05)。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

2.5 PAE对OCI-LY3细胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表达的影响 见表2。与对照组比较,PAE低浓度组、PAE中浓度组、PAE高浓度组p53表达增加,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表达降低(均P<0.05)。与PAE高浓度组比较,PAE高浓度+SC79组p53表达水平降低,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表达增加(均P<0.05)。

表2 各组细胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表达比较

3 讨 论

DLBCL是一种起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤,有遗传异质性和显著的表型。在目前的临床治疗中,大多数DLBCL患者生存时间短,虽然其治愈率得到改善,但临床疗效仍不令人满意,多数患者在肿瘤复发后病死[10-12],因此迫切需要开发新的治疗策略提高DLBCL的治疗效果。

寻找中药活性成分并揭示其潜在抗肿瘤作用机制已成为当今医药研究的热点[13]。PAE是芍药的主要成分之一。作为一种活性化合物,PAE通过影响细胞凋亡、周期停滞、上皮-间质转化和迁移等不同细胞生物学过程,在各种类型的肿瘤中表现出潜在的抗肿瘤作用[14]。SI等[15]研究发现,PAE可减少结肠肿瘤的数量和大小,提高小鼠的存活率。PAE可抑制人B细胞急性淋巴细胞白血病Nalm-6和SUP-B15细胞增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,为白血病的治疗提供潜在药物[16]。细胞周期对于控制细胞增殖至关重要,而对细胞增殖的抑制是由于细胞生长停滞在细胞周期的G1或G0/G1期[17],本研究发现PAE可以剂量依赖的方式抑制细胞克隆形成数及增殖率,使细胞周期停滞G0/G1期,提示PAE具有抗肿瘤细胞增殖的作用。肿瘤的发展受细胞增殖和凋亡间的平衡控制,诱导细胞凋亡被认为是一种有吸引力的治疗策略[18]。本研究发现,PAE可以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡,表明PAE的抗肿瘤作用可能通过抑制OCI-LY3细胞增殖促进其凋亡的实现。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,作为一种经典的细胞内信号轴,可通过多种机制与肿瘤发生相关,许多类型恶性肿瘤如子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌和肝癌的发生均与AKT异常磷酸化水平的增加有关[19]。例如,抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信号表达可抑制人结直肠癌的生长,促进其凋亡[20]。作为AKT的重要下游靶标,MDM2可在AKT活化后磷酸化并易位至细胞核,从而抑制肿瘤抑制蛋白p53表达,因此AKT/MDM2/p53信号通路在细胞周期、增殖和凋亡的调节中具有重要作用[21-22],抑制这一途径的新型药物是治疗肿瘤的途径之一[23]。例如,小檗胺治疗后可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可能是通过调节PI3K/AKT/MDM2/p53信号通路初步实现的[24]。在结直肠癌研究中,木香烃内酯被证明是一种新的AKT抑制剂,通过抑制AKT的磷酸化来抑制MDM2泛素化,从而激活和诱导p53的稳定性,进而抑制大肠癌细胞生长并诱导细胞凋亡[25]。本研究发现,经PAE处理OCI-LY3细胞后,可显著抑制AKT磷酸化水平,进而降低MDM2水平,上调p53表达,进而抑制OCI-LY3细胞增殖,诱导细胞周期停滞,促进其凋亡,提示在DLBCL发展过程中AKT/MDM2通路作用可能被促进,进而抑制了抑癌基因p53表达,使得癌细胞的功能增强,但PAE可能作为一种AKT抑制剂逆转了上述通路的表达,从而抑制了OCI-LY3细胞的恶性行为发展。最后实验以AKT/MDM2/p53信号通路激活剂SC79进行了回复验证,结果发现经PAE高浓度+SC79共同处理后,细胞凋亡率、p53表达、G0/G1期显著降低,细胞克隆形成数、增殖率、p-AKT/AKT表达、p-MDM2/MDM2表达、G2/M期、S期显著增加,表明SC79逆转了PAE高浓度对OCI-LY3细胞恶性行为的抑制作用,提示PAE可能通过抑制AKT/MDM2/p53信号通路抑制DLBCL细胞增殖,诱导其凋亡及细胞周期停滞。

综上所述,PAE通过抑制AKT/MDM2上调p53表达,抑制DLBCL细胞增殖、细胞周期进展,诱导其凋亡,可作为AKT抑制剂参与治疗DLBCL。但由于细胞研究单一且缺乏动物体内实验,实验结论仍需针对上述不足进一步完善。