从NF-κB/Bcl-2信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡角度探讨中医药抑制类风湿关节炎滑膜炎症机制的研究进展*

陈 平,杜小正,王海东,井维尧,刘 翠,李浩林,陶鹏飞,王金磊

(1.甘肃省中医院风湿骨病中心,甘肃 兰州 730050; 2.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜炎症为主要病理特征的系统性慢性自身免疫性疾病,发病迅速,具有进行性、破坏性、致残性等特点,对人类健康造成严重危害[1]。RA具体发病机制尚不明确,但持续的滑膜炎症是导致RA病情发展的最主要因素。临床给予氨甲蝶呤、来氟米特、糖皮质激素等药物治疗RA,可明显改善病情,延缓疾病进展,但长期用药不仅会使患者产生耐受,还会对患者的循环系统、消化系统等造成损害[2]。中医药治疗RA具有一定优势,但作用机制不明是限制中医药发展的难题。成纤维样滑膜细胞( fibroblast-like synoviocytes,FLS)是介导RA滑膜炎症的主要效应细胞[3],FLS激活后可产生大量炎症因子,引发炎症级联反应。RA-FLS具有抗凋亡的特性,其不断的增殖和迁移是导致血管翳生成及骨破坏的关键原因[4]。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/ B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信号通路在FLS的抗凋亡过程中发挥重要作用。研究显示,RA-FLS中NF-κB表达异常增高,能转录大量的Bcl-2调控线粒体,并介导FLS抗凋亡[5]。因此,调控NF-κB/Bcl-2信号通路活性是促使FLS凋亡、抑制RA滑膜炎症的关键。笔者从NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡角度探讨中医药抑制RA滑膜炎症机制的研究进展,综述如下。

1 RA-FLS抗凋亡是介导RA滑膜炎症的核心因素

FLS的生理增殖与间充质干细胞从循环中迁移或滑膜中干细胞池的扩大有关,但在RA中,FLS增殖原因尚不明确,可能是由于细胞增殖、生存和死亡的失衡造成。研究[6]表明,RA滑膜组织具有高度遗传毒性,其活性氮和活性氧水平增高造成的氧化应激反应足以使细胞凋亡;即使FLS的DNA损伤、DNA链断裂增加,经TUNEL检测、组织形态测定及电子显微镜检查,FLS的凋亡程度仍然处于较低水平。

RA患者的滑膜组织从静止的相对无细胞结构转变为充满免疫细胞的增生性浸润组织后,活化的FLS便迅速增殖,促使血管翳形成[7],并进一步增加自身抗凋亡能力。同时,FLS通过产生炎症因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、趋化因子和基质降解分子等,增强侵袭能力,并附着在骨表面,加速对骨关节的损伤和破坏[8]。

原位杂交和免疫组化研究[9]表明,内膜中的FLS是白细胞介素(interleukin,IL)-6的主要来源,培养的FLS自发产生IL-6,且IL-1或TNF通过核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)依赖性途径促进IL-6产生,充分说明FLS具有促炎作用,也说明IL-6抑制剂能改善RA的体征和症状;同时,研究表明,关节中的集落刺激因子主要来源于RA-FLS,这些生长因子具有增加骨髓中造血干细胞谱系特异性成熟的能力,在树突状细胞和巨噬细胞活化中起着关键作用,其粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子在RA滑膜和滑膜积液中含量丰富,并经原位杂交研究证实其主要由RA-FLS产生。研究表明,IL-1或TNF刺激可显著增加FLS中GM-CSF的水平,此为诱导巨噬细胞局部扩张和活化的关键环节[10]。

实验证明,FLS细胞膜上Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)存在高表达现象,而滑膜组织中大量的高迁移率族蛋白B1、透明质酸及热休克蛋白等物质可作为损伤相关的分子模式激活TLR通路,介导胞内磷脂酰肌醇3激酶、丝裂原活化蛋白激酶、NF-κB等多种炎症通路激活,从而活化炎症网络[11]。此外,活化的FLS还将诱导辅助性T细胞(helper T cell ,Th)1、Th17等多种免疫细胞迁移至关节中,分泌IL-6、IL-17等多种炎症因子,协同RA-FLS加重炎症反应[12]。同时,RA-FLS可内吞中性粒细胞胞外陷阱,获得抗原呈递细胞的能力并将其呈递给CD4+T细胞,这一过程是诱导自身免疫反应的关键[13]。

综上可知,FLS是介导RA滑膜炎症的主要效应细胞,其抗凋亡特性是加重RA滑膜炎症的关键因素,促进FLS凋亡是抑制RA滑膜炎症的可靠目标。

2 NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡是抑制RA滑膜炎症的关键靶点

Bcl-2是一种癌基因,具有明显抑制细胞凋亡的作用,不仅可以抑制由多种细胞毒素引起的细胞死亡,还可促使细胞在无生长因子环境下存活。在Bcl-2蛋白家族中,Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白,Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)是主要的促凋亡蛋白,两者动态变化可引起线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeability,MOMP)改变,从而激活线粒体凋亡通路[14]。Bcl-2蛋白一般位于线粒体或内质网上,其含有的多个BH结构域通过阻断BH3-only蛋白与其激活剂和增敏剂的结合来阻滞凋亡程序,从而抑制MOMP发生。研究[15]证实,在RA的发病过程中,Bcl-2呈明显高表达状态,且TNF-α及IL-1β容易刺激RA-FLS导致Bcl-2出现高表达现象,从而证实RA炎症与FLS抗凋亡是相互促进的。然而,在RA机体中,BAX表达水平升高的幅度远远低于Bcl-2,故Bcl-2/BAX极易升高,导致滑膜细胞增殖/凋亡失衡,必然促进RA的发生发展,加重RA症状。

Bcl-2的关键启动子多个分布于NF-κB上,而NF-κB感受细胞调节,使NF-κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)激酶磷酸化后释放NF-κB关键位点并移位至细胞核,调控Bcl-2蛋白的表达,进而调控细胞凋亡过程[16]。RA患者外周血中磷酸化NF-κB抑制蛋白α、NF-κB p65亚基、Bcl-2等明显高表达,证实NF-κB/Bcl-2通路在RA中具有关键作用[15]。实验[16]表明,RA大鼠滑膜组织Bcl-2明显高表达,但BAX信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)及蛋白质水平升高幅度远远低于Bcl-2水平,从而造成滑膜细胞增殖/凋亡失衡,促使RA发生发展。研究[17]证实,上调FLS中NF-κB、Bcl-2蛋白水平,可抑制FLS凋亡,促使FLS分泌IL-6、TNF-α等炎症因子。相反,沉默NF-κB基因或使用NF-κB抑制药物硼替佐米等干预能下调RA-FLS中Bcl-2的水平,促使FLS凋亡,减少TNF-α、IL-1β产生[18-19]。研究[20]发现,采用香附素处理RA-FLS后, Bcl-2表达明显下调,BAX、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9表达上调,且呈剂量依赖性下调IκB和NF-κB磷酸化水平,诱导RA-FLS细胞凋亡,减轻炎症反应。体内研究[21]表明,栀子有效成分AC-5GP可抑制RA大鼠体内炎症反应;进一步研究发现,AC-5GP可抑制NF-κB核移位,降低Bcl-2蛋白水平,增加BAX、Caspase-3表达,促使FLS凋亡。

综上所述,NF-κB/Bcl-2是调控RA-FLS凋亡的关键信号通路,抑制其活性可以促使RA-FLS凋亡,此为缓解RA滑膜炎症反应的关键靶点。

3 NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡在中医药抑制RA炎症反应中的作用

研究表明,中药[22]、针灸[15]等方法治疗RA疗效显著,可延缓病情发展,减轻炎症反应。但中医药基础研究薄弱,这也是限制其临床发展的关键。因此,明确中医药治疗RA的具体分子机制是支撑中医药高质量发展的坚实基础,有利于中医药成果的转化。

凋亡与抗凋亡的调节失衡是RA-FLS加重滑膜炎症的关键原因,而中医药具有调节机体平衡和稳态的作用,可以通过调节内稳态失衡治疗RA。因此,从NF-κB/Bcl-2信号通路及调控FLS凋亡角度探讨中医药治疗RA的机制具有可行性,可能是中医药治疗RA的关键靶点。

3.1 中药治疗

临床研究[23]表明,二妙散是治疗RA的经典方剂,能明显改善RA大鼠的关节滑膜增生、软骨破坏和滑膜炎症。体外研究[24]发现,二妙散水提取物可以降低胶原诱导的关节炎大鼠FLS中NF-κB mRNA及蛋白表达,抑制FLS的增殖和迁移。刘颖姝[25]采用益气养阴通络方治疗RA取得良好疗效,通过网络药理学分析发现,其作用机制与诱导FLS凋亡有关;体外研究进一步证实,益气养阴通络方可以通过抑制NF-κB通路活性减少Bcl-2的表达,促使FLS凋亡。然而,由于中药复方成分复杂,其基础研究仍然存在困难。对中药单体及其有效成分的研究能为中药复方的临床运用提供一定的基础。

研究[26]表明,类牡丹提取物可以缓解RA-FLS炎症反应,促进FLS凋亡,抑制血管翳形成,其机制与抑制NF-κB p65、NF-κB p50、Bcl-2及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)活性有关。迷迭香具有健脾、止痛的功效,在RA的治疗中备受关注。迷迭香有效成分鼠尾草酸具有抗炎止痛、抗氧化的作用,可抑制RA大鼠踝关节滑膜组织中NF-κB p65、IκB的表达水平,减少IL-6、TNF-α等炎症因子释放。相关研究[27-28]证实,Bcl-2是鼠尾草酸的作用靶点之一,可通过促进细胞凋亡抑制多种癌症进展,但其在RA-FLS凋亡中的作用仍需进一步明确。苦参具有清热燥湿的作用,常用于湿热型RA的治疗,其有效成分苦参碱被证实具有促进FLS凋亡的作用。研究[29]显示,苦参碱能通过干预CIA大鼠抑制大鼠滑膜组织中NF-κB、Bcl-2 mRNA的表达,提高BAX mRNA的表达,减少Caspase-1蛋白表达,达到抑制滑膜增殖和炎症浸润、减轻关节肿胀的目的,但该研究未直观地对滑膜组织进行凋亡检测,尚存在一定不足。研究[30]显示,使用吴茱萸苷干预RA-FLS可通过抑制NF-κB/Bcl-2信号通路活性增加BAX的表达,诱导线粒体障碍,促使FLS凋亡,最终发挥抗炎作用。欧前胡素是白芷的主要有效成分。研究[31]证实,欧前胡素能降低NF-κB和Bcl-2的表达,提高BAX的表达,抑制FLS增殖并促使其凋亡。

3.2 中医外治

针灸作为一种安全、便捷的中医外治法被广泛用于RA的治疗。RA缓解期单独使用针灸治疗可稳定病情,改善关节运动功能[32];活动期采用针灸联合改善病情的抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)治疗能加速降低疾病活动度,缓解临床症状。

研究[33]表明,电针联合西药治疗RA的疗效明显优于单纯西药治疗,可改善患者关节功能评分、双手握力、晨僵时间等,降低红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive proten,CRP)和类风湿因子(rheumatoid factor,RF)水平。实验研究[34]表明,电针干预RA大鼠足三里穴、关元穴可明显改善足趾肿胀程度,降低炎症因子水平,其机制与促进FLS凋亡有关。艾灸是临床常用的RA外治法,其温热效应可以温阳散寒和扶正祛邪,改善RA临床症状及疾病活动性评分28(disease activity score in 28-joints,DAS28)评分,配合西药使用可提高疗效,降低疾病活动度[35]。研究[36]表明,艾灸可改善RA大鼠组织肿胀程度,促使FLS凋亡。胡枝敏等[36]发现,不同的灸量对FLS凋亡率有不同影响,30 min艾灸可更大程度促进FLS凋亡,改善RA大鼠炎症反应。

近年来,针刀治疗RA获得临床广泛认可。针刀治疗具有见效快的特点,可改善患者关节功能,减轻疼痛。临床研究[37]表明,针刀治疗RA可有效改善患者VAS 评分、DAS28 评分,降低血清ESR、RF、CRP水平。实验研究[37]发现,针刀干预RA可以提高大鼠滑膜组织中Caspase-3、Caspase-9 mRNA水平,提示针刀的作用机制可能与促进FLS凋亡有关。研究[38]发现,针刀干预可以下调Bcl-2 mRNA水平,降低Bcl-2/BAX蛋白表达的比值,但其具体作用机制仍需要进一步探讨。

4 小结与展望

RA-FLS是滑膜组织中最关键的细胞之一,具有增殖、侵袭、迁移及抗凋亡的特点,可促使滑膜组织血管翳形成并加重骨破坏进程。诱导RA-FLS是治疗RA的关键环节。Bcl-2在RA-FLS中高表达,起到抑制RA-FLS凋亡的作用。通过抑制NF-κB信号通路活性可以降低Bcl-2表达,调节Bcl-2与BAX的比值,促使RA-FLS凋亡,进而改善RA滑膜炎症。

中药治疗是RA临床常用的治疗方法,中药的单体药物研究为中成药的运用提供了一定的基础,如雷公藤多甙、白芍总苷等药物已广泛并成熟运用于临床[39]。许多中药复方及单体药物可以诱导RA-FLS凋亡,其机制与抑制NF-κB/Bcl-2信号通路密切相关。针灸是一种安全、便捷的中医外治法,临床治疗RA疗效显著。有实验[40]表明,电针具有减轻滑膜炎症的作用,但其调节FLS凋亡等作用需要进一步研究。针刀基于现代解剖,在中医经筋理论的指导下治疗RA疗效确切,易被患者接受。目前研究[41]显示,针刀治疗RA的机制与诱导FLS凋亡有关,但其上游机制仍不明,且缺乏更直观的研究结果。

综上所述,NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡在中医药临床研究中具有很大的潜力。多维度论证中医药干预方法对FLS凋亡的影响,为中医药改善RA滑膜炎症机制提供坚实的理论和实验证据,有利于推动中医药治疗RA的快速发展。