葛根素口服给药对急性酒精中毒解酒作用的研究

范志铭，张耿强，蔡舒冰，李晓霞，何宇

（广州医科大学第六临床学院，广东清远 511500）

急性酒精中毒（acute alcohol intoxication，AAI）是指短时间摄入大量酒精或含酒精饮料后而引起的中枢神经系统功能紊乱状态，临床表现为行为和意识异常[1]。此外，持续大量饮酒还可诱发肝细胞广泛坏死，进而发展成急性酒精性肝炎（acute alcoholic hepatitis，AAH），严重者损伤脏器功能，危及生命[2]。调查指出，我国饮酒人群及人均饮酒量呈不断攀升的趋势，酒精滥用及依赖成为公共卫生问题[3]，急性酒精中毒已成为急诊科最常见的中毒之一。无论是国内还是国外，发病均呈上升趋势，严重危害人民健康。因此，寻找有效的解酒预防药物受到人们的普遍重视。

葛根[Pueraria lobata（Willd）Ohwi]为豆科植物野葛的干燥根，葛根素（Puerarin）是从中分离得到的主要生物活性成分，化学名为8-β-D-葡萄叱喃糖-4，7-二羟基异黄酮（8-β-D-Glucopyranosy-7，4-hydroxyisoflavone）。葛根在解酒、治酒病方面的明确疗效自古以来就有记载。《本草衍义》中记载以葛根解酒护肝，曰：“病酒及渴者，行之甚良”。现代药理研究结果表明，葛根素具有扩张冠脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、降低血液黏稠度、改善循环等作用，可以降低小鼠酒精吸收量，加速酒精代谢，提高对酒精耐受量的作用[4]。葛根素制剂有注射液、冻干粉针剂、滴眼剂等，在临床时一般选择注射给药，但未有口服给药。近年来，不少关于葛根素注射液不良反应的报道出现，轻者可表现为红斑、瘙痒、皮疹、丘疹等皮肤黏膜改变，重者会导致变态反应、药物热、溶血性贫血、过敏性休克等全身症状，其安全性引起了医药界的高度重视。这大大威胁着用药者用药安全，亟需改进[5]。鉴于葛根素注射液的使用不便及高不良反应率，本研究通过葛根素口服给药，不但使用方便，而且可避免其注射给药带来的不良反应。

因此，本研究通过观察葛根素口服给药后急性酒精中毒小鼠的肝系数和血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）浓度，对小鼠翻正反射消失时间和躯体麻痹症状持续时间的影响，以及小鼠肝组织病理形态学变化，探讨葛根素口服给药对急性酒精中毒的解酒保护作用，为葛根素解酒保肝制剂的开发提供实验依据。

一、材料和仪器

（一）实验动物

清洁级健康小鼠24只，雌雄不拘，体重为20～24g，由广州医科大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（粤）2021-0168。动物饲养条件：普通级动物室；室温：（25±2）℃；相对温度：（40±2）%；通风、光照良好，采用标准饲料喂养，自由摄食饮水。

（二）药品及试剂

生理盐水；红星二锅头（由北京红星股份有限公司第一分公司生产，产品标准号为：GB/T10781.2）；葛根素溶液（用生理盐水配备成浓度为0.3g·ml-1的溶液）；丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）测定试剂盒（由中生北控生物科技股份有限公司提供，产品批号：182651）；其余均为分析纯、生化试剂。

（三）实验仪器

HH-W420型数显三用恒温水箱（常州金坛精达仪器制造有限公司）；722s可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；JJ300A型电子天平（美国双杰兄弟〔集团〕有限公司）；OLYMPUS CX23高清数码拍摄显微镜（湖南亮晰光学仪器有限公司）。

二、方法

（一）动物分组、造模及给药

本研究随机将小鼠分为正常对照组、模型组和葛根素组，每组8只。除正常对照组外，其余各组小鼠均按0.15ml·10g-1灌胃56°二锅头白酒进行造模[6]。葛根素组按照0.3g·ml-1葛根素溶液0.2 ml·10g-1灌胃，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。

（二）指标检测

给药2h后，研究人员观察各组小鼠酒精灌胃前后有无死亡，外观、行为活动、精神状态等有无明显异常，观察药物灌胃后各组小鼠有无出现死亡、兴奋狂躁、共济失调、活动减少、嗜睡等表现，观察并记录小鼠翻正反射消失的时间（当小鼠出现动作不协调的症状时，轻柔地翻转小鼠，使之处于侧卧位，20s之内不能自主翻正，则判断翻正反射消失。当小鼠恢复自行翻转时，则认为翻正反射恢复）和躯体麻痹症状持续时间（从翻正反射消失至恢复翻正反射的总时长）。待小鼠躯体麻痹症状解除，麻醉后尾静脉取血5mL，常温下静置血样15min，4℃、400g离心10min，取血清按试剂盒说明书检测小鼠血清中的ALT浓度，之后处死小鼠，测量小鼠的体重，取肝组织，测量肝脏湿重，计算小鼠的肝系数（肝系数＝肝脏湿重/小鼠重量×100%）。

（三）组织病理形态学观察

研究人员取肝实质部位，于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡浸润包埋并制作成厚度为4μm的连续石蜡切片，置于电热恒温干燥箱中，60℃烘烤2h，烘烤完毕对干燥的石蜡切片进行二甲苯透明和梯度乙醇脱蜡后，蒸馏水洗，苏木素溶液染色5min、1%盐酸乙醇分化30s、0.5%伊红水溶液染色3min，进行常规HE染色，水洗冲掉残留染液，切片经梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片。使用光学显微镜于10×40倍视野下随机选择一个视野观察并拍照，观察肝脏组织病理学变化。

（四）统计学方法

本研究采用 SPSS 25.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料数据以表示，组间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05认为差异有统计学意义。

1.葛根素对急性酒精中毒小鼠中枢神经系统的影响

酒精灌胃后，各组小鼠均无出现死亡，小鼠均出现明显的醉酒状态，先表现为躁动不安，后表现为活动减少和动作不协调，紧接着随后出现昏迷、昏睡、躯体麻痹，而葛根素组小鼠给药后精神状态、活动能力均较模型组明显改善。翻正反射时间反应醉酒潜伏期。与模型组相比，葛根素组小鼠给药后精神状态、活动能力明显改善，葛根素组翻正反射消失时间为[（368.80±115.80）s]，躯体麻痹症状持续时间为[（13.77±2.76）s]。与模型组翻正反射消失时间[（173.30±90.50）s]和躯体麻痹症状持续时间[（25.22±7.93）s]相比，翻正反射消失时间延长（P＜0.05），躯体麻痹症状持续时间缩短（P＜0.05），说明葛根素口服给药可减轻急性酒精中毒小鼠的中枢神经系统症状。葛根素对急性酒精中毒小鼠神经系统的影响详见表1。

表1 葛根素对急性酒精中毒小鼠神经系统的影响（± s，n=8）Table 1 Therapeutic effects of pueraria on central nervous system in acute alcohol intoxications mice（± s，n=8）

与模型组比较：*P＜0.05，*P＜0.05

组别 剂量/ml·10g-1小鼠体重/ g翻正反射消失时间*/ s躯体麻痹症状持续时间*/ min正常对照组 NS 21.42±0.74 ——模型组 NS 21.65±1.04 173.30±90.50 25.22±7.93葛根素组 0.20 21.76±0.98 368.80±115.80 13.77±2.76

2.葛根素对急性酒精中毒小鼠肝功能的影响

肝系数反映小鼠肝脏的肿胀程度，是肝脏炎症严重程度的指标。当肝脏出现水肿、充血或炎症时，肝系数会明显增大。正常对照组肝系数为[（5.53±0.32）%]，葛根素组为[（5.72±0.36）%]，模型组为[（7.22±0.93）%]。与模型组相比，葛根素可降低肝系数（P＜0.05），具有统计学意义（如图1）。研究人员处死小鼠，取出肝脏，模型组小鼠的肝脏炎症症状较其他组明显，体积增大、质地坚实、边缘圆钝、包膜紧张、充血红肿。HE染色镜下显示，正常对照组小鼠肝脏形态正常，模型组小鼠肝脏汇管区肝细胞出现大块带状坏死，细胞肿胀，炎性浸润，胞质疏松呈网状，出现嗜酸性变，胞核固缩碎裂，坏死细胞约占82%，而葛根素组小鼠肝细胞散在坏死，约占69%，葛根素组坏死肝细胞百分占比低于模型组，肝细胞坏死情况明显改善（如图2）。另外，肝细胞内含有大量的ALT，受损的肝细胞会释放大量的ALT入血，导致血清中ALT浓度明显上升。正常对照组血清ALT浓度[（28.04±1.70）μg·L-1]，葛根素组为[（107.88±1.88）μg·L-1]，模型组为[（252.90±9.72）μg·L-1]。从实验结果来看，模型组小鼠血清中ALT浓度显著升高，葛根素可抑制血清ALT浓度的升高（P＜0.05），有效防治急性酒精性肝炎（如图3）。结果表明，葛根素口服给药可保护急性酒精中毒小鼠的肝功能。

图1 各组小鼠的肝系数

图2 小鼠肝脏HE 染色结果

三、讨论

根据上述实验结果，葛根素口服给药对急性酒精中毒小鼠具有一定的解酒作用，能缩短小鼠翻正反射消失时间和躯体麻痹症状持续时间，还可降低肝系数，减低血清ALT浓度，显著减轻酒精对小鼠肝细胞的损害，对急性酒中毒小鼠肝功能有明显保护作用，佐证了其临床用药的可行性和有效性。

葛根素是从葛根中提取出的主要活性物质，其药理作用广泛，早在唐代就已经有“解酒毒”作用的记载，食药兼用历史悠久，其作用机制可能为通过延缓胃排空，减慢酒精吸收速率，降低肠壁通透性，从而降低酒精对中枢神经系统和肝脏的损害[7]。同时，酒精大部分在肝脏中进行代谢排出体外，其中主要的途径为乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）将酒精氧化为乙醛，乙醛再通过乙醛脱氢酶氧化为乙酸。张伟等人的一项研究表明，葛根素预处理可以使酒精中毒小鼠肝脏的乙醇脱氢酶活性升高[8]，还可以灭活细胞色素CYP2E1，从而减少乙醇在分解代谢中产生的自由基，减轻酒精对肝细胞的损伤[9]。此外，葛根素还可以刺激腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，进而阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）S6核糖体蛋白和4E结合蛋白-1表达，使乙醇培养的肝细胞恢复自噬，减轻急性酒精中毒对肝脏的损害[10]。

此外，葛根素还可以抑制内毒素肠漏、库普弗细胞活化和内毒素受体表达减轻急性酒精中毒对肝脏的损害。彭靖华等人[11]发现口服葛根素可逆转大鼠酒精摄入引起的谷草转氨酶、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶和甘油三酯水平升高，抑制酒精诱导的肝小叶和脂肪肝中性粒细胞浸润，并阻断酒精刺激下TNF-α、内毒素、内毒素受体活性、肝脏CD68、CD14、LPS结合蛋白和Toll样受体2/4表达水平的上调，调整肠微绒毛的分布，下调肠闭锁小带-1蛋白（Intestinal zonula occludens-1）表达水平。

但是，由于葛根素具多苯环和多羟基的结构，在水中微溶，且口服后难以被胃肠道等生物膜吸收，生物利用度较低，限制了其口服给药的应用[12]。因其水溶性差，所以厂家在生产葛根素注射剂时需要加入高浓度的丙二醇作助溶剂，通过增大药物的黏稠度来提高利用度。这样不仅在生产过程中增加成本，而且乙二醇有引起发热、过敏性休克等过敏反应的风险[13]。不少学者对葛根素的口服制剂方面进行了广泛研究，主要是改善葛根素溶解度和生物利用度，尚未取得较好的进展[14]。近年来，随着纳米技术在多领域的广泛应用，开发出葛根素磷脂复合物、葛根素缓释复合骨架片、葛根素纳米粒等制剂，使得葛根素均匀分散，更容易透过生物膜，增加了溶解度和生物利用度[15]。有学者研究发现，纳米化葛根素能显著增加葛根素在水中的溶解度，提高口服葛根素的生物利用度，且纳米化的葛根素平均滞留时间、消除半衰期比口服葛根素溶液和葛根素混悬液有明显延长，药时曲线下面积（Area Under Curve，AUC）、峰浓度也有较大提高，达峰时间明显提前，显示了纳米化葛根素能使葛根素的吸收增加，作用增强或延长[16]。目前，纳米化葛根素进入药效、毒理的全面评价研究阶段。因此，这可成为葛根素口服给药剂型开发的一个研究方向[17]。