沉默信息调节因子2 介导蛋白质去乙酰化与卵母细胞衰老

金清美，韩乔松，梁竞男，周悦，孙振高，宋景艳

沉默信息调节因子（silence information regulator，sirtuin，SIRT）蛋白是一类进化保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）组蛋白脱乙酰酶，属于Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase，HDAC），SIRT2 是sirtuin 家族的一员，存在于卵母细胞细胞核和细胞质中，促进细胞成熟。研究发现，SIRT2 抑制会引起纺锤体缺陷、染色体错位、氧化应激以及线粒体分布异常，导致卵母细胞减数分裂缺陷[1]。近年来，研究显示衰老的卵母细胞中SIRT2 蛋白水平降低，纺锤体/染色体缺陷的频率增加[2]。衰老的卵母细胞线粒体功能和纺锤体组装异常可能最终导致卵母细胞非整体性增加[3]。卵母细胞非整倍体性是高龄女性生育能力下降的主要原因，增加了不孕、流产或胎儿先天性缺陷的风险，并且影响辅助生殖技术的助孕结局。一项回顾性研究显示，卵母细胞非整倍体影响胚胎的发育潜力，在体外培养过程中，非整倍体胚胎比整倍体胚胎更容易在囊胚期之前发育停滞，且优质囊胚为整倍体的可能性高于非整倍体[4]。由此可见，SIRT2 精准调控细胞周期过程从而产生健康的卵母细胞，对高龄女性妊娠结局具有重要的意义。

1 SIRT2 在卵母细胞中的定位

蛋白质分子在细胞内准确的定位是其发挥功能的前提和基础，细胞正常的生理活动与蛋白质的亚细胞定位密切相关。免疫组织化学（immunohistochemistry）和蛋白质印迹（Western blotting）结果显示，SIRT2 在牛颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞和卵膜细胞中均有表达[1，5]，SIRT2 在减数分裂期表达处于高水平状态，尤其是在第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ，MⅡ）卵母细胞中[1]，因此，SIRT2 可能对牛卵泡的发育和成熟起重要作用。Ferreira 等[6]研究发现，随着卵母细胞周期的进程不断发展，SIRT2 从生发泡（germinal vesicle，GV）早期细胞质外周穿梭进入到GV2 期的细胞核中，调节异染色质和核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）基因沉默，此外，研究还发现SIRT2 在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ，MⅠ）、第一次减数分裂后期（anaphase Ⅰ，AⅠ）和MⅡ期与纺锤体表现出很强的相关性，这表明SIRT2 可能在牛卵母细胞减数分裂过程中对纺锤体组装具有重要的作用。由此可见，SIRT2 与卵母细胞减数分裂过程密切相关。

2 SIRT2 介导蛋白质去乙酰化调控减数分裂过程

2.1 SIRT2 和间隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）Cx43 是细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication）的主要介质，在卵巢中表达最为丰富，主要存在于颗粒细胞中[7]。众所周知，间隙连接和旁分泌因子介导卵母细胞与颗粒细胞之间双向信号通讯，促进卵泡的正常生长发育。

2020 年的一项研究显示，SIRT2 通过丝裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinases，MEK）去乙酰化抑制细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）介导的Cx43 丝氨酸368 位点（Ser368）磷酸化，从而调控牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulusoocyte complex，COC）的间隙连接通讯[8]。ERK1/2 介导的Cx43 Ser368磷酸化也是17β-雌二醇调控猪[9]和山羊[10]COC 间隙连接通讯的潜在机制，参与卵母细胞核成熟和减数分裂恢复。Cx43 Ser368 磷酸化会降低原代和永生化人颗粒黄体细胞（human granulosa lutein cell）间隙连接通讯的活性[11]。既往研究表明，间隙连接通讯维持卵母细胞内适当的环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，有利于GV 期卵母细胞染色质重塑和转录调控[12]。卵母细胞内cAMP 减少触发的减数分裂恢复与Cx43 磷酸化增加介导的间隙连接通讯关闭相关。抑制牛COC 中SIRT2 活性，过早破坏Cx43 介导的间隙连接通讯，反而会阻碍卵母细胞核成熟，影响卵母细胞发育能力[8]。这可能是因为提早关闭间隙连接通讯影响营养物质和信号分子向卵母细胞输送，卵母细胞内cAMP 水平过早降低影响染色质结构和功能的分化。有研究显示，诱导卵母细胞体外成熟（in vitro maturation）前，使用cAMP/环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）调节剂人工维持减数分裂阻滞可以提高体外成熟卵母细胞发育能力，cGMP 通过抑制磷酸二酯酶3（phosphodiesterase 3，PDE3）对cAMP 的分解，从而抑制促成熟因子（maturation promoting factor）的活性以维持GV 阶段的减数分裂阻滞，延长卵母细胞-卵丘细胞间隙连接通讯，并允许时间赋予卵母细胞在核成熟之前的发育能力[13]。卵泡抑素（follistatin）通过抑制cGMP 的降解和暂时延迟核成熟挽救了体外成熟质量较差的猪卵母细胞发育至囊胚期的能力[14]。

由此可见，卵母细胞减数分裂受SIRT2/MEK/ERK/Cx43 信号通路调控。此外，SIRT2 还可以直接介导Cx43 去乙酰化来维持Cx43 在卵丘细胞上的膜定位，从而调控牛COC 中的间隙连接通讯[8]。

2.2 SIRT2 和组蛋白H4 第16 位赖氨酸（H4K16）组蛋白H4K16 的乙酰化是真核生物中普遍存在的可逆的翻译后染色质修饰，掺入核小体阵列可抑制致密30 纳米样纤维的形成，具有阻碍染色质形成交叉纤维相互作用的能力[15]。缺乏HDAC2 的小鼠H4K16乙酰化增加，可能会导致染色体在卵母细胞成熟过程中不能完全凝集，并损害着丝粒功能[16]。2020 年一项研究显示，通过SIRT2 介导H4K16 去乙酰化能够减少小鼠卵母细胞着丝点和微管（kinetochoremicrotubule）异常结合及染色体分离错误，挽救生殖年龄相关的卵母细胞缺陷表型[2]。小鼠卵母细胞中染色体凝集和着丝粒功能缺陷与H4K16 高乙酰化引起组蛋白H3 第3 位苏氨酸（H3T3）磷酸化和组蛋白H3 第10 位丝氨酸（H3S10）磷酸化水平降低有关[17]。H4K16 乙酰化、H3T3 磷酸化和H3S10 磷酸化间交叉对话也存在于猪卵母细胞，影响着丝点-微管的稳定性、着丝点的拉力以及mRNA 的转录[18]。在人肿瘤细胞中发现，抑制组蛋白去乙酰化降低了着丝粒组蛋白H3S10 的磷酸化水平，在S 期添加组蛋白去乙酰化抑制剂会导致有丝分裂S 期和G2 期着丝粒区上异染色质蛋白1-β（heterochromatin protein 1-β，HP1-β）降低，减少了极光激酶B（aurora kinase B）在着丝粒上的定位，极光激酶B 可以催化组蛋白H3S10磷酸化，从而导致着丝粒组蛋白H3S10 磷酸化水平降低，随后M 期着丝粒组装出现缺陷；该研究还发现，抑制组蛋白乙酰化后，hBUB1、着丝粒蛋白F（centromere associated protein F，CENP-F）和CENP-E在细胞着丝粒上表达减少[19]。在有丝分裂和减数分裂过程中H3T3 磷酸化能够将染色体移动复合体（chromosomal passenger complex）招募到内着丝粒上纠正着丝点-微管的异常结合，其催化成分是极光激酶B，而极光激酶B、内着丝粒结合蛋白（inner centromere protein，INCENP）、存活蛋白（survivin）和Borealin/Dasra B 等蛋白分子组成染色体移动复合体，调控着丝粒的功能[20-21]。

此外，卵细胞减数分裂过程中，DNA 的损伤也会影响卵母细胞的质量。最近研究发现，SIRT2 介导H4K16 去乙酰化是修复癌细胞DNA 损伤的新途径，SIRT2 通过与牛痘病毒相关性激酶1（vaccinia virus associated kinase 1，VRK1）相互作用，抑制MYST 组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）家族中的TIP60（tat interacting protein 60 kD）/赖氨酸乙酰转移酶5（lysine acetyltransferase 5，KAT5）的活性，介导H4K16 去乙酰化，过量的H4K16 乙酰化会导致染色质松散和染色质可接近区域DNA 损伤并干扰DNA 修复途径[22]。

2.3 SIRT2 和α-微管蛋白（α-tubulin）微管是α-微管蛋白和β-微管蛋白动态聚合形成的细长管状的细胞骨架结构，调节细胞分裂、细胞迁移以及细胞内运输等细胞生命活动。微管结构和功能的多样性受微管蛋白翻译后修饰调控，常见的有乙酰化、泛素化、磷酸化和甲基化等，α-微管蛋白乙酰化是目前研究最多的微管蛋白翻译后修饰，其乙酰化位点位于微管腔内第40 位赖氨酸上，与细胞环境中微管稳定性相关[23]。

研究发现，驱动蛋白家族成员15（kinesin family member 15，KIF15）[24]、RAB23/KIF17[25]以及KIF18A[26]可以通过SIRT2 调控小鼠卵母细胞α-微管蛋白乙酰化水平，影响微管的稳定性。SIRT2 水平增加导致小鼠α-微管蛋白乙酰化水平降低，破坏微管的稳定性和着丝点-微管结合，导致纺锤体/染色体缺陷，产生非整倍体卵母细胞[27]。但通过抑制卵母细胞中SIRT2 活性引起α-微管蛋白乙酰化水平过度增加反而会导致牛[1]和小鼠[28]卵母细胞纺锤体/染色体缺陷。α-微管蛋白乙酰化减少了α-α 或β-β 横向接触，削弱了原丝之间的相互作用，降低成核频率，加速微管收缩[29]，原丝之间较少的相互作用增加了微管的灵活性，使得微管抗机械应力的能力增强[29-30]。微管过于稳定使微管动力学失衡，可能也会导致小鼠卵母细胞减数分裂过程中纺锤体组装缺陷[31]。由此可见，α-微管蛋白乙酰化水平的平衡调节微管的稳定性和微管动力学，对纺锤体正常组装和染色体正确分离至关重要，但目前对于α-微管蛋白高乙酰化影响微管动力学存在争议，有待进一步研究。

2.4 SIRT2 和BUBR1BubR1（bub-related 1）是酵母细胞有丝分裂监测点基因家族Mad3（mitotic arrest-deficient 3）的同源基因，是纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）的重要组成部分，SAC 监控着丝粒和纺锤体微管连接以确保细胞分裂过程中染色体正确分离。BUB1 和BUBR1 的主要作用是感受有丝分裂姐妹染色单体着丝点上的张力[32]。

老年小鼠卵母细胞中SIRT2 蛋白丢失，导致BUBR1 赖氨酸243 位点（BUBR1-K243）高乙酰化，损害了着丝点-微管之间的相互作用，引起纺锤体/染色体缺陷以及产生非整倍体卵子[33]。破坏微管稳定性和着丝点-微管附着会诱导SAC 蛋白激活，扰乱小鼠卵母细胞减数分裂中的细胞周期进程[34]。SAC首先被单极纺锤体1（monopolar spindle 1，MPS1）激酶激活，MPS1 激酶触发有丝分裂检查点复合体（mitotic checkpoint complex，MCC）的募集和形成，MCC 由MAD1、MAD2、BUB3 和BUBR1 组成，随后，MCC 扩散到细胞质中并隔离细胞周期分裂蛋白20（cell division cycle 20，CDC20），CDC20 是一种后期促进复合物/细胞周期体（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）的激活剂，抑制了分裂后期APC/C 的活性，从而抑制细胞周期蛋白B（cyclin B）和分离酶抑制蛋白（securin）的泛素化和降解，最终导致细胞周期阻滞，直至着丝粒正确附着在微管上[35]。既往研究发现，随着年龄增长，人单个卵母细胞中BUB1B的平均转录水平逐渐降低，39 岁患者BUB1B 平均转录水平比31 岁患者减少了1.5 倍，BUB1B 转录水平的下降显著降低了BUBR1 蛋白水平[36]。衰老的卵母细胞中BUBR1 蛋白水平的降低破坏了SAC 的功能，SAC 反应减弱，即使是未附着的着丝点也会导致分裂后期开始，导致染色体分离错误，产生非整倍体卵子。老年小鼠体内BUBR1 蛋白水平的降低与NAD+和SIRT2 维持BUBR1 赖氨酸668 位点（BUBR1-K668）处于去乙酰化状态的能力下降有关，通过SIRT2 过表达或用NAD+前体烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）处理可以增加BUBR1 的蛋白水平[37]，该位点的乙酰化促进了BUBR1 的泛素化和降解，通过SIRT2 可以逆转BUBR1-K668 的乙酰化，从而保护BUBR1 免受泛素化和降解的作用[38]。除了上述泛素－蛋白酶体系统作用外，Goutas 等[39]对BUB1B/BUBR1 降解途径提出了新的观点，在细胞衰老过程中，蛋白酶体功能随着细胞衰老而衰退，BUB1B/BUBR1 从依赖蛋白酶体降解向选择性自噬降解转变，选择性自噬降解BUB1B/BUBR1 促使细胞衰老开始，可以避免细胞向癌细胞转化，为有丝分裂错误驱动衰老的机制提供了见解。

由此可见，SIRT2 可能通过调控卵母细胞内BUBR1 蛋白水平参与减数分裂过程。但Lagirand-Cantaloube 等[40]发现，高龄妇女卵母细胞中BUBR1蛋白水平是恒定的，这一结果与上文相矛盾，这可能是两者的研究对象卵母细胞群存在差异，从而导致结果不同，除此之外，研究中还发现BUB1 和BUBR1 在着丝点上的定位随着年龄的增长而减少，这可能导致卵母细胞为非整倍体。

2.5 SIRT2 和叉头框蛋白O3a（forkhead box O3a，FOXO3a）FOXO 是调控细胞周期进程、DNA 修复、抗氧化损伤和细胞凋亡的转录调节因子，FOXO蛋白家族的功能是由翻译后修饰调节的，包括磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化等，微管蛋白翻译后修饰受不同细胞应激的影响作用于FOXO 蛋白，调控其亚细胞定位、转录活性以及DNA 结合特性等[41]。

FOXO3a 是SIRT2 的靶点之一，SIRT2 介导的FOXO3a 去乙酰化与大鼠大脑细胞衰老、凋亡以及氧化应激密切相关[42]。在氧化应激作用下，SIRT2 通过去乙酰化FOXO3a 增加小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）FOXO3a 的核定位以及与DNA 结合的活性，上调FOXO3a 靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B（cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，p27Kip1）、锰超氧化物歧化酶（mananese superoxide dismutase，Mnsod）和Bcl-2 样蛋白11（Bcl-2-like protein 11，Bim）的表达[43]。在牛卵母细胞体外成熟过程中也观察到了相似的结果，SIRT2 介导的FOXO3a去乙酰化促进了FOXO3a 核定位和转录活性，随后超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2）和过氧化氢酶（catalase）的表达增加[1]。卵母细胞对氧化应激的响应可能是通过SIRT2 介导的FOXO3a 去乙酰化来调节的。FOXO3a mRNA 表达水平在GV 破裂、MⅠ和MⅡ期明显升高，在MⅡ期达到高峰，与年轻小鼠相比，老年小鼠FOXO3a 的表达水平显著升高，并在MⅡ期普遍定位于染色质[44]。由此可见，衰老的卵母细胞处于一定的氧化应激，SIRT2 对衰老的卵母细胞的影响可能是通过FOXO3a 去乙酰化暂停细胞周期进程，允许细胞分裂之前修复DNA 损伤并去除活性氧，从而改善卵母细胞的质量。

3 结语

SIRT2 对卵母细胞成熟至关重要，SIRT2 通过对Cx43、组蛋白H4K16、α-微管蛋白、BUBR1、FOXO3a等蛋白质直接和间接去乙酰化作用，调控减数分裂恢复、纺锤体组装、染色体凝集和排列、氧化应激以及线粒体功能和分布等活动，以获得健康的卵母细胞。目前研究发现，随着年龄增长，卵母细胞中SIRT2 水平降低，容易引起减数分裂缺陷，而减数分裂缺陷产生的非整倍体卵母细胞是高龄女性生育能力下降的主要原因。因此，提高高龄女性卵母细胞中SIRT2 水平对获得高质量的卵母细胞具有重要的意义，但目前对于SIRT2 调控卵母细胞减数分裂过程的相关机制尚不清楚，有待进一步研究。