抑癌基因WWOX在胃癌中的表达及其临床意义

胡 浩， 赵荣飞， 曹 苇

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，位居癌症死因的第二位，是一类多基因疾病，是由于端粒酶激活、凋亡基因失调、癌基因的激活以及抑癌基因的失活、突变等引发的多因素、多阶段、多基因变异的复杂综合病变过程。目前研究者们认为抑癌基因的失活在肿瘤发生发展过程中可能起到更加常见、更加重要的作用，WWOX就是近年来发现的一个与多种肿瘤发生有关的新型抑癌基因。本文检测胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织标本中WWOX基因mRNA的表达情况，探讨其失活与胃癌发生的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为苏州大学附属第一医院2006年10月至2007年5月间52例胃癌患者行根治手术切除的标本，包括胃癌组织及与癌组织相对应的癌旁正常胃黏膜组织(手术切缘距肿瘤边缘5 cm以外)各52例，所有病例术前均未行化、放疗，术后均经病理证实。其中男性37例，女性15例，年龄27～80岁，中位年龄62岁。参照1990年WHO推荐的分化分级标准，低分化腺癌31例，中分化腺癌18例，高分化腺癌3例；根据国际抗癌联盟(UICC，1997)TNM分期法，Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期29例和Ⅳ期12例。上述标本离体后半小时内取材，然后迅速置于-196℃液氮冷冻后移至-80℃冰箱保存，用于提取mRNA。

1.2 主要试剂与仪器

总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司，M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂 RNAsin、Taq DNA聚合酶购自Promega公司，DNA分子量标准购自MBI公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR仪(PE 2400)为美国Perking Elmer公司产品，紫外透视分析仪Bio-CAPT version99为VLIBER LOURMAT 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 合成引物 WWOX上游引物为5′-TTTGGAGCGGGAGTGAGT-3′，下游引物为5′-GTGGTGCTGCCGTCGTAT-3′，扩增片段413bp；内参照GAPDH 上游引物为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物为5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，扩增片段258 bp。

1.3.2 组织总RNA抽取 用TRIzol一步法进行组织内总RNA的提取，紫外分光光度仪测定A260、A280吸光值，RNA样本的A260/A280应在1.8～2.0之间，计算RNA含量，稀释RNA到0.5 μg/μL，-80℃保存。

1.3.3 RT-PCR反应 RT反应：RNA逆转成WWOX

cDNA；PCR反应：扩增WWOX cDNA，扩增反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延长1 min，共38个循环，72℃延长7 min。

1.4 PCR扩增产物的半定量分析

采用UVIDoc软件，对电泳图像中的目的基因和内对照GAPDH的扩增产物条带分别进行光密度值分析。通过计算表达指数(目的基因条带的光密度值/相应的GAPDH条带的光密度值)，对目的基因的表达进行半定量分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常胃黏膜组织中WWOX mRNA的表达

WWOX mRNA在胃癌组织、相应癌旁正常胃黏膜组织中均有表达(图1)，WWOX mRNA在胃癌组织中的表达水平低于癌旁正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 WWOX mRNA的表达：RT-PCR产物(413bp)电泳条带注：N 癌旁正常胃黏膜组织；T 胃癌组织；Mark为ladder标记

标本例数WWOXmRNA表达指数(x±s)Z值P值胃癌组织520．3404±0．2800癌旁正常胃黏膜组织520．6139±0．22205．1409P<0．0001

2.2 胃癌组织中WWOX mRNA的表达与临床病理学指标的关系

胃癌组织中WWOX mRNA的表达与胃癌组织的分化程度、TNM分期以及浸润深度明显相关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤生长部位、肿瘤大小以及淋巴结转移、远处转移等无关(P>0.05)，见表2。

表2 WWOX mRNA在胃癌组织中的表达指数与 临床病理学指标的关系

3 讨论

全球每年死于胃癌的患者约70万人，其中42%分布于中国[1]。尽管长期以来进行深入而广泛的研究，但其病因和发病机制尚未完全明确。迄今为止，还没有研究出能够证明胃癌的发生是单一因素直接作用的结果。目前，抑癌基因与胃癌的发生、发展关系的研究尤为引人关注。WWOX基因是Bednarek等[2]于2000年在16q23.3～24.1区域克隆出的一个新抑癌基因，体内及体外研究和WWOX基因敲除的小鼠模型的建立也均证明了WWOX是一个抑癌基因[3-4]。WWOX基因通过失活或蛋白失去功能启动肿瘤的发生或促进肿瘤的进展，其失活的机制尚未完全明确，可能与杂合性丢失(LOH)和纯合性丢失、mRNA转录缺失或严重降低致蛋白表达的缺失或降低、氧化还原酶区域(SDR)破坏、启动子CpG岛甲基化有关。也有研究者提出了WWOX基因失活的两次打击学说，即WWOX基因中某单一基因的缺失，引起基因表达的异常，以后其他突变机制引起WWOX的进一步改变，两次打击的发生导致两等位基因失活且完全丧失功能。

本研究胃癌组织中WWOX mRNA的表达率为67.3%(35/52)，相应癌旁正常胃黏膜组织中WWOX mRNA的表达率为92.3%(48/52)，统计学分析显示，胃癌中WWOX mRNA的表达水平低于癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05)，说明WWOX基因mRNA的缺失和低表达在胃癌中具有普遍性，证实WWOX基因的缺失与胃癌的发生密切相关。通过对WWOX基因的表达与胃癌临床病理学指标关系的进一步分析显示：胃癌组织中WWOX mRNA的表达与性别、年龄、肿瘤生长部位、肿瘤大小以及淋巴结和远处转移无关(P>0.05)，而与胃癌的分化程度、TNM分期以及浸润深度明显相关(P<0.05)，且组织学分化程度越低，TNM分期越晚，浸润程度越深，WWOX mRNA的表达缺失就越高，提示WWOX基因表达缺失或低表达可能是胃癌发生发展中的晚期事件，可见WWOX基因的改变与胃癌的发生、发展密切相关。

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics，2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108.

[2] Bednarek AK, Laflin KJ, Daniel RL,et al.WWOX, a novel WW domain-containing protein mapping to human chromosome 16q23.3-24.1,a region frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res, 2000,60(8):2140-2145.

[3] Fabbri M, Iliopoulos D, Trapasso F, et al. WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro and in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(43): 15611-15616.

[4] Aqeilan RI, Trapasso F, Hussain S, et al. Targeted deletion of Wwox reveals a tumor suppressor function [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007, 104(10):3949-3954.