结核分支杆菌耐药基因的杂交检测

韩中波　周亚丽

【摘要】 目的 采用PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链霉素耐药性，探讨直接检测结核患者痰标本的可行性。方法 用PCR-反向斑点杂交技术分析对75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测。结果 临床耐药株分离株进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测，其突变率分别为83．9％、62．5％、57．1％。肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为81．0％、60．0％、52．9％。结论 rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关，应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性。PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。

【关键词】结核分支杆菌；反向斑点杂交；药物耐受性

近年来全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福平（RFP）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视。传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6～8周时间，不能及时指导临床用药。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶－过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性；耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致；结核分支杆菌耐RFP与其核心区域rpoB基因突变有关^[1、2]。笔者采用采用PCR－反向斑点杂交技术分别对肺结核患者痰标本临床分离株和结核患者痰标本直接进行KatG基因、rpsL基因、rpoB基因的突变检测，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1．1 标本来源 75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所，其中31例耐RFP，28例耐INH，24例耐SM。 45例肺结核患者涂阳痰标本按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中21例耐RFP，17例耐INH，20例耐SM。

1．2 细菌DNA的制备^[3]临床分离株DNA用常规酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。

1．3 PCR扩增 采用25 ul反应体系，4×dNTPs终浓度为0．2 mmol／L，Bio-标记引物终浓度为0．2 umol／L，扩增程序为：94℃变性I min，58℃退火1 min，72℃延伸I min，循环30次，最后72℃延伸10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现267 bp条带。

1．4 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中，加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交：45℃×30 min。将Bio-标记引物的PCR扩增阳性产物变性：95 ℃×l0 min，取出迅速放入冰盒中，每ml杂交液一般加 l0ul变性的扩增产物，放置水浴锅中进行杂交：45℃×30 min。洗膜：洗液1 、45℃× 3 min，洗液2 、45℃×3 min。SA-AP：用l：1000的稀释液(洗液I)与膜在37℃作用30 min。洗膜：洗液I、45℃× 3 min，洗液II 、45℃×3 min。显色：每毫升洗液I加入NBT 6．6ul、BICP 3．3ul混匀，将配好的显色液加入杂交袋中，闭光37℃显色5 min，观察结果

2 结果

应用PCR-反相斑点杂交技术检测rpoB、rpsL和KatG基因突变结果（见表1、2）。75株临床分离株进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测，PCR扩增均为阳性，其耐药株突变率分别为83．9％、62．5％、57．1％，其敏感株突变率分别为0、0、2．1％。

45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测，其耐药株突变率分别为81．0％、60．0％、52．9％, 其敏感株突变率分别为0、4．1%、3．7％。

3 讨论

目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需6～8周甚至更长，不能及时指导临床用药。Bactec结核培养系统因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛使用。近年来，随着分子生物学的不断发展已研究发现结核分支杆菌耐RFP与其核心区域rpoB基因突变有关，结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶－过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性；耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致。

本实验室前期通过PCR-SSCP方法得出耐异烟肼时，KatG基因突变率为63．1%，耐链霉素时，rpsL基因突变率为72．2%，耐利福平时，rpoB基因突变率为90．1%^[3]。但PCR-SSCP方法建立在凝胶电泳基础上，难于标准化和质量控制，难以大规模推广。通过对KatG、inhA、rpsL、rrs基因核心易变区进行DNA序列分析。根据基因突变的中心区域，设计靶基因，制备寡核苷酸探针，点样在杂交膜上，进行PCR－寡核苷酸探针反相斑点杂交。

PCR-反相斑点杂交检测临床分离株rpoB、rpsL和KatG基因突变，耐药株的rpoB、rpsL和KatG基因突变率分别为83．9％、62．5％、57．1％，这与一些报道相近^[4]。还有2．1%的敏感株KatG基因发生突变，原因有待于进一步探讨。PCR－反向斑点杂交技术直接检测了54例肺结核患者痰标本，耐药株突变率分别为81．0％、60．0％、52．9％。突变率略低于其临床分离株。这可能是由于痰标本杂质多，同时痰标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增有直接影响。PCR－反向斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌rpoB、rpsL和KatG基因突变，可在2 d内出结果，从而弥补了常规药敏实验的不足，有望成为临床耐药性测定的重要手段之一。

参考文献

［1］ Williams D, Waguespack C, et al. Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38: 2380-2386.

［2］ Morris S, Bai GH, et al .Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis ,JID,1995,171:805.

［3］ 张永胜，李书琳，张小刚，等.结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究.中国医师杂志， 2002，4(4)：374-375.

［4］ 庄玉辉，何秀云，张小刚，等.耐利福平结核分支杆菌耐药分子机制的研究. 中华结核和呼吸杂志，2000，23：711-714.