ｐ２１、ｐ２７和ｂｃｌ－２在大肠癌、大肠腺瘤及正常大肠黏膜中表达的意义及相关性研究

魏茂富　卢义生　刘镜文　刘冠兰　张彩弟　康东平

[摘要] 目的：探讨p21、p27、bcl- 2蛋白在大肠癌、大肠腺瘤及正常大肠黏膜中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化方法,分别检测20例正常大肠黏膜、22例大肠腺瘤和69例大肠癌中p21、p27、bcl- 2蛋白表达情况。结果：p21、p27、bcl- 2蛋白总阳性表达率分别为44.93%、50.72%、52.17%，各种蛋白的阳性表达率在大肠癌组织与对照组间存在的差异有统计学意义(P<0.05) 。其中发生淋巴结转移的大肠癌组织中p21阳性表达率高于无淋巴结转移的大肠癌组织中的阳性表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)；p27蛋白的表达与肿瘤分化程度呈负相关(P<0.05)；在发生淋巴结转移的大肠癌组织中bcl-2阳性表达率低于无淋巴结转移的大肠癌组织中的阳性表达率，差异具有统计学意义(P<0.05)，高分化、中分化腺癌与低分化腺癌相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，TNM Ⅳ期bcl-2表达率显著低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期（P<0.05）。结论：p21、p27、bcl- 2蛋白与大肠癌的发生、发展有密切关系，联合检测p21、p27、bcl-2对于临床诊断大肠癌及判断病情、预后有重要意义。

[关键词] p21；p27；bcl-2；大肠腺瘤；大肠癌

[中图分类号]R735.3+4 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721（2009）02（a）-022-04

Study of expression of p21, p27, bcl-2 in colorectal carcinoma, adenoma and normal tissues

WEI Mao-fu1,LU Yi-sheng2,LIU Jing-wen1,LIU Guan-lan1,ZHANG Cai-di1,KANG Dong-ping3

(1. Department of Pathology, Humen Hospital, Dongguan 523900,China;2. Department of Pathology, Peoplep's Hospital of Dongguan, Dongguan 523018,China;3.Department of Pathology, Taiping Hospital, Dongguan 523900,China)

[Abstract] Objective:To investigate the relationship between the expression of p21, p27, bcl-2 in the normal colorectal mucous membrane, colorectal adenoma ,carcinoma and clinicopathologic features. Methods:The expression of p21, p27, bcl-2 was detected respectively in 69 patients with colorectal carcinoma , 22 with colorectal adenoma and 20 normal colorectal mucous membrane by the immunohistochemical staining. Results:The frequency of p21, p27, bcl-2 staining in carcinoma tissues is 44.93%、50.72%、52.17%, respectively , being significantly difference in positive rates of these protein of control sample (P<0.05). The positive rate of p21 immunostaining was 70.83% in patients with lymphytic metastasis being significantly higher than that of in patients without lymphytic metastasis 31.11%(P<0.05) . A statistically significant difference in p27 staining was found in relation to the histologic grade (P<0.05). The positive rate of bcl-2 immunohistochemical staining was 33.33% in patients with lymphytic metastasis, compared with 62.22% in patients without lymphytic metastasis (P=0.022 1). A statistically significant difference in bcl-2 staining was found in relation to the histologic grade(P<0.05). Staining frequency for bcl-2 in TNM Ⅳ was significantly lower than those of TNM Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ(P<0.05) . Conclusion:The results suggest that p21, p27, bcl-2 protein have relations with the genesis and development of colorectal carcinoma. The detection for these proteins will play an important part in clinical diagnosis and prognosis.

[Key words] p21; p27; bcl-2; Colorectal adenoma; Colorectal carcinoma

分子生物学研究表明大肠癌的发生、发展是一个多因素共同参与的多阶段复杂生物学过程, 其与癌基因激活, 抑癌基因失活密切相关。为此我们对大肠癌组织中p21、p27、bcl-2 基因同时进行检测, 以探讨各基因在大肠癌组织中表达的临床意义以及相互关系。

1材料与方法

1.1标本来源

收集我院及东莞市太平人民医院2003年3月～2008年3月手术切除经病理证实的大肠腺瘤标本22例,大肠癌标本69例，另外选取正常大肠黏膜标本20例作为对照观察。69例大肠癌标本中, 男38例,女31例，年龄28～82岁，平均年龄59.1岁,术前均未作任何抗肿瘤治疗。高分化腺癌5例,中分化腺癌17例,低分化腺癌47例。24例有淋巴结转移。TNM分期:Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期23例、Ⅳ期9例。

1.2试剂及免疫组化染色方法

鼠抗人p21、p27、bcl-2单克隆抗体、抗体稀释液及试剂盒均购自基因公司。p21稀释度为1∶50，P27、bcl-2稀释度为1∶200。所有标本均用10 %中性甲醛固定,石蜡包埋,4 μm 连续切片,按二步法法进行免疫组化染色,染色前标本切片进行抗原修复处理，一抗在室温孵育1 h，二抗在室温下孵育0.5 h，DAB 显色，苏木素复染。用已知阳性的大肠癌标本作p21、p27、bcl-2抗体的阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3判断标准

所有免疫组化片子用奥林帕斯BX50显微镜进行定性和半定量评估。请3个高职称病理医生在不知道临床信息的情况下独立的对所有免疫组化片子进行评估。阳性判断标准为细胞核、细胞浆和(或)细胞膜出现了黄色或棕黄色颗粒状,并用阳性片作为对照。每张切片随机选择10个视野,40×10 高倍显微镜下观察计数。

p21参照文献[1]方法根据染色的强度及阳性细胞的数量分别记分。A :染色强度，不着色为0 分,淡黄色为1 分,黄色为2 分,棕黄色为3 分。B :阳性细胞所占百分率，<5%为0分，5%～25%为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分。根据染色强度与阳性细胞数得分之和分为4级,即(－)为0分,弱阳性( + )为1～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分。将A×B作为其染色的计数,只有A×B>3分才算免疫反应阳性,并按乘积分数将染色结果分为4个等级:- (0～2分)、+ (3～5分) 、+ + (6～8) 分和+ + + (9～12) 分。≥6分为高表达, < 6分为低表达。

p27参照文献[2]，a：染色强度(0分为阴性,1 分为淡黄色，2分为棕黄色,3分为棕褐色)；b：阳性细胞所占百分率(0分为阴性,1 分为阳性细胞数≤25%，2分为阳性细胞数26%～50%，3分为阳性细胞数51%～74%，4分为阳性细胞数≥75%) 。将a×b作为其染色的计数,只有a×b> 3分才算免疫反应阳性,并按乘积分数将染色结果分为4个等级:- (0～2分) 、+ (3～5分) 、+ + (6～8) 分和+ + + (9～12) 分。≥6分为高表达, <6分为低表达。

bcl-2参照文献[3]方法根据染色的强度及阳性细胞的数量分别记分。不着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。无阳性细胞染色为0 分,阳性细胞数少于30%为1分,31%～70%为2分,70%以上为3分。根据染色强度与阳性细胞数得分之和分为4级,即(-)为0分,弱阳性(+) 为1～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++) 为5～6分。

1.4统计学方法

统计学处理应用SPSS10.0软件进行χ2检验和Fisher确切概率法，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

p21、p27阳性表达主要表现为胞核染色，bcl-2阳性表达主要表现为胞质染色。p21、p27、bcl-2蛋白总阳性表达率分别为44.93%、50.72%、52.17%，各种蛋白的阳性表达率在大肠癌组织与对照组间差异有统计学意义(P<0.05) （表1）。

p21表达在69例大肠癌中阳性表达率为44.93%（图1）；22例大肠腺瘤中阳性表达率为18%；20例正常大肠黏膜中阳性表达率为15%。正常黏膜与大肠腺瘤的阳性表达率基本相同（P=0.890 1）,两者的阳性表达率与大肠癌相比差异有统计学意义(P<0.05)（表1）。在发生淋巴结转移的大肠癌组织中p21阳性表达率为70.83%,高于无淋巴结转移的大肠癌组织中p21 (31.11%)的阳性表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)，而与临床其他病理因素均无相关性(P>0.05)（表2）。

p27表达在69例大肠癌中阳性表达率为50.72%（图2）; 22例大肠腺瘤中阳表达率为86%; 20例正常黏膜中阳性表达率为90%。正常黏膜与大肠腺瘤的阳性表达率基本相同(P>0.05)，两者的阳性表达率与大肠癌相比差异有统计学意义(P<0.05) （表1） 。在高、中、低分化腺癌中p27kip1 表达率分别是100.00%、88.24%和31.91%，高分化腺癌与中分化腺癌相比差异没有统计学意义(P=1.000),而两者与低分化腺癌相比差异有统计学意义(P<0.05)，与临床其他病理因素均无相关性(P>0.05) （表2）。

bcl-2表达在69例大肠癌中阳性表达率为52.17%（图3）;22例大肠腺瘤中阳表达率为50%;20例正常黏膜中阳性表达率为20%。大肠癌与腺瘤的阳性表达率基本相同（P=0.859 0），两者的阳性表达率与正常大肠黏膜相比差异有统计学意义(P<0.05) （表1）。在大肠癌组织中bcl-2 表达率与性别、年龄和肿瘤大体类型均无相关性。但在高、中和低分化腺癌中bcl-2 表达率分别是100.00%、82.35％、36.17％,高分化、中分化腺癌与低分化腺癌相比,差异均有统计学意义(P值分别为0.023 2、0.001 1)；TNM临床分期Ⅳ期bcl-2 表达率显著低于Ⅰ期（P＝0.019 8）、Ⅱ期（P＝0.049 1）、Ⅲ期（P＝0.044 3），相互比较差异均有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移组中bcl-2表达率为33.33％ ,无淋巴结转移者为62.22％，二者比较差异有统计学意义(P=0.022 1)（表2）。

3讨论

p21是当今医学界肿瘤治疗中受关注的焦点[4]。p21的过表达可使细胞周期阻滞于G1期、G2期或S期[5]。大肠癌中p21蛋白表达阳性率均显著高于大肠腺瘤和正常大肠黏膜(P<0.05) ，正常黏膜与腺瘤的阳性表达率基本相同（P=0.890 1）。在发生淋巴结转移的大肠癌组织中p21阳性表达率高于无淋巴结转移的大肠癌组织中的阳性表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)；pP21阳性表达与临床其他病理因素均无相关性(P>0.05)。从而表明p21能够预测大肠癌预后,可以作为肿瘤的一个标记物，并可作为一种临床诊断标记,便于早期发现,早期诊断,也可作为潜在的治疗靶点,进而有效地降低肿瘤的生物学恶性程度,提高患者的生存质量,并延长其生存时间,有一定的临床意义。

p27是近年发现的与细胞周期调控相关的重要基因, 其表达产物p27蛋白参与细胞的增殖、分化调控和凋亡, 对细胞周期具有负调控作用, 被认为是抑癌基因[6]。Loda等[7]采用免疫组化的方法分析了149例原发性结肠癌中p27的表达，应用多因素分析表明,p27是独立的预后指标。尤其在Ⅱ期肿瘤,p27kipl缺乏对结肠癌是一个有力的负性预后指标, 有助于确定哪些病人可进行辅助治疗, 使p27kipl无表达或低表达者从中受益。本组研究中, 正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌中均有p27kipl表达, 腺瘤及正常大肠黏膜的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)，大肠癌的阳性表达率与大肠腺瘤及正常大肠黏膜比较差异有统计学意义(P<0.05)。我们的研究表明高分化腺癌与中分化腺癌相比差异没有统计学意义(P=1.000),而两者与低分化腺癌相比差异有统计学意义(P<0.05)，表明p27的表达与肿瘤分化程度呈负相关，而与临床其他病理因素均无相关性(P>0.05)，故p27蛋白检测可作为评价大肠癌恶性程度的重要指标。