人类外周神经在化学萃取前后的组织形态变化研究

赖英荣　朱庆棠　刘小林

【摘要】 目的 研究人类外周神经在化学萃取前后的组织形态变化，探讨化学萃取法制备人类长段粗大去细胞神经的可行性。方法 用Triton X-100和脱氧胆酸钠对人体长段胫神经作不同次数的萃取处理，经常规HE染色、砂罗铬花青、网状纤维组织化学染色和S-100免疫组织化学染色后，在光镜下观察神经萃取前后的组织形态变化，并比较不同萃取次数对神经结构的影响。结果 人体长段胫神经经2次萃取后，其轴突、髓鞘、许旺细胞及其他结缔组织中的细胞均已消失，仅见网格纤维，而神经基底膜管、神经束膜等纤维性支架保存完整，与未经萃取的神经相仿。萃取1次者仍残留少量细胞碎屑，而萃取3次者，细胞清除更彻底，但纤维性支架结构明显破坏。结论 人类长段粗大神经干经化学萃取后不含细胞，而保留有完整的纤维性支架结构。化学萃取法制备人类长段粗大去细胞神经可行。

【关键词】 外周神经;人类;化学萃取;组织形态

Study on the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction

LAI Ying-rong, ZHU Qing-tang,LIU Xiao-lin.

Department of Pathology Ist Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080 China

【Abstract】 Objective To investigate the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction, and assess the feasibility of preparing human acellular nerve graft through chemical extraction. Methods Long segments of human tibia nerve were treated with Triton X-100 and sodium deoxycholate for different times. The nerves were sectioned, stained with HE, myelin (Page), reticular fiber (Gordon-Sweet), and S-100, and then examined under light microscope. The histomorphology of the nerve extracted for different times were compared.Results Extracted for 2 times, the axons, myelin, Schwann Cells and other cells in the connective tissue disappeared, while the reticular fiber, neural basal membrane tubes and perineuriums were preserved. The fiber framework of the extracted nerve was similar to that of the nerve prior to extraction. Cell debris was found in the nerve extracted for 1 time. When the nerve was extracted for 3 times, cells were removed completely. However, the fiber framework was destroyed. Conclusions Extracted with chemical agents, the cells in the long and thick human peripheral nerve are removed, while the fiber framework can be preserved. Human acelluar nerve can be made through chemical extraction.

【Key words】 Peripheral nerve;Human;Chemical extraction;Histomorphology

近年来随着人工材料在生物医学领域的广泛应用，人们不断尝试用人工合成的材料或生物材料制成神经导管，作为神经的再生通道，但受到材料加工技术的限制，至今仍未能制成具有周围神经复杂三维结构支架。自Dumont等^［1］和 Sondell等^［2］报道用化学萃取法可去除大鼠坐骨神经中的细胞而保留神经基底膜管以来，人们还用类似方法制备了兔、犬和猴的去细胞神经^［3-5］。这种方法既除去了神经中的抗原成份，降低神经免疫原性的同时又保留了神经复杂的三维支架结构，为制备仿生化的人工神经支架材料开辟了新途径^［6,7］。本文参照Sondell等的方法处理人类长段粗大的外周神经，通过观察其大体及组织形态学上改变，探讨该方法能否制备长段粗大的去细胞神经支架，为以后制备具有人类神经天然结构的仿生化神经提供实验依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 人体周围神经的来源与萃取

人体神经取自一大腿创伤性截肢患者捐献的废弃肢体，切取其胫神经，自股骨髁至内踝全长40 cm。将神经截成4段，每段10 cm，直径为6 mm，取其中3段神经按下列步骤进行萃取，余下的新鲜神经作对照。①在10倍手术显微镜下剪去神经周围的脂肪和部分神经外膜，保留神经束以及连接神经束的部分外膜;②用1000 ml蒸馏水泡6 h，每2 h换液1次;③放入300 ml 3%TritonX-100溶液中，室温下静置12 h;④在1000 ml蒸馏水中震荡、漂洗3遍，10 min/次;⑤放入4%脱氧胆酸钠溶液中，室温下震荡24 h;⑥在1000 ml蒸馏水中震荡、漂洗3遍， 10 min/次。每次萃取均重复步骤③~⑥，3段神经分别萃取1、2、3次。

1.2 标本的处理

神经萃取后于其中段切取1 cm长的组织，另取1 cm长的新鲜胫神经作对照。标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，分别进行HE染色、组织化学染色砂罗铬花青染色和网状纤维染色以及S-100免疫组织化学染色。光镜下观察神经萃取前后其组织形态的变化。

2 结果

2.1 大体上观察 新鲜神经外观完整，丰满坚韧富有弹性，萃取后的神经疏松，乳白色，质地柔软。

2.2 光学显微镜下观察 ①HE染色，未经萃取的神经可见神经轴突、许旺细胞、束膜细胞、成纤维细胞，以及散在分布的细胞，经1次萃取后仍隐约见个别许旺细胞以及成纤维细胞，纵横切面神经结构完整，清楚。经2次萃取后，神经内见不到细胞，蓝染的细胞核消失，神经内仅见网格纤维，纵横切面神经结构基本完整。经3次萃取后，神经内所有细胞消失，横切面见神经皱缩，结构破坏，纵切面见神经束散乱；②砂罗铬花青染色，未经萃取的神经，神经髓鞘被染成鲜蓝色，红细胞深蓝色，胶原纤维鲜红色，细胞核和核仁蓝色，经萃取1次、2次、3次后的神经砂罗铬花青染色均为阴性；③网状纤维染色，未经萃取神经，可见网格纤维及细胞核，而萃取后的神经只见网格纤维，细胞核则未见显示；④S-100染色，未萃取神经呈阳性，经1次萃取后的神经，横切面见神经内出现少量棕色的阳性反应信号，经2次萃取后的神经内基本看不到阳性反应信号，经3次萃取后神经内检测不到阳性反应信号。

3 讨论

近年来，随着人工材料或生物材料在生物医学领域的广泛应用，人们不断尝试用人工合成的材料或生物材料制成神经导管，作为神经再生的临时通道。周围神经损伤后,再生轴突在物理性通道的引导下通过神经缺损区，同时需要许旺细胞分泌多种因子促进其再生。自体神经有完整的神经基底膜管作为再生通道，是修复神经缺损的理想材料，但自体神经来源有限，且会产生新的神经损伤。异体或异种神经虽有完整的神经基底膜管，但异体(种)神经移植往往会因排斥反应而失败。外周神经主要含有构成神经纤维的轴突、髓鞘和许旺细胞，构成血管的细胞以及神经束的神经束膜细胞和外膜细胞，这些细胞具有强免疫原性，是引起异体（种）神经移植排斥反应的主要物质。Dumont等和Sondell等先后报告了用不同的化学药物清除大鼠周围神经中的细胞、髓鞘及其崩解碎片的方法^［1,2］。化学萃取法制备大鼠10 mm长的去细胞坐骨神经获得成功，神经萃取后仅剩下神经基底膜管和神经结缔组织中胶原成份，其免疫原性大为降低。但此方法能否去除长段、粗大的人类外周神经中的细胞，仍有待摸索。本实验参照Sondell等方法来萃取10 cm长、直径为6 mm的胫神经，详细研究了不同萃取次数后神经在大体、常规HE、组织化学和免疫组织化学检测所见的形态变化。萃取1次神经内残留少量细胞碎屑，萃取2次仍有极少量S-100残留而基底膜管和神经束膜等纤维性支架完整，萃取3次，破坏神经支架结构。萃取后的神经束内所有的细胞包括许旺细胞、束膜细胞、成纤维细胞、血管的内皮细胞和平滑肌细胞均已消失，神经髓鞘和轴突被清除。本实验结果显示萃取神经的组织形态及组织抗原与萃取次数有密切关系，萃取2次较为理想。同时本实验还证明了用化学萃取法清除人类外周神经中的细胞而保存纤维性支架是可行，采用该方法可制备长段粗大的人类去细胞神经。

参考文献

［1］ Dumont CE , Hentz VR .Enhancement of axon growth by detengent-extracted nerve grafts .Transplantation ,1997 ,63:1210-1215.

［2］ Sondell M , Lundborg G ,Kanje M .Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction .Brain Res ,1998,795:44-54.

［3］ 李跃军, 陈绍宗, 李学拥, 等.去细胞异体神经材料复合碱性成纤维细胞生长因子修复周围神经缺损.中华创伤杂志,2003,19(8):491-493.

［4］ 衷鸿宾,侯树勋,陈秉耀.犬化学去细胞神经同种异体移植的实验研究.中华创伤骨科杂志,2004,6(4):418-422.

［5］ 衷鸿宾,侯树勋,陈秉耀.灵长类去细胞神经的萃取制备及异体移植后早期神经再生观察.中华创伤骨科杂志,2004,6(6):657-660

［6］ 孙明学,唐金树,王鑫,等.去细胞处理对化学去细胞异体神经免疫原性的影响.中华外科杂志,2006,44(4):275-278.

［7］ 许扬滨,胡军,江长青,等.用去细胞同种异体神经构建猕猴组织工程化神经的实验研究.中华显微外科杂志,2005,28:136-138.