降解麦秸木质素菌种的筛选及发酵条件研究

马立安，赵雷鸣，陈启武

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

降解麦秸木质素菌种的筛选及发酵条件研究

马立安，赵雷鸣，陈启武

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

通过驯化、发酵筛选等方法，从供试的5株侧耳菌(Pleurotus)中选育到1株具有较高降解木质素的白腐类真菌P802，接种发酵10 d后，木质素降解率为38%，对麦秸中纤维素降解率为8.10%。该菌株降解麦秸粉木质素的最适pH为4.0～4.5，最适温度30.4 ℃。

侧耳菌(Pleurotus)；麦秸；木质素；发酵；降解

麦秸等农作物秸秆主要含有果胶、木质素、半纤维素及纤维素，其中纤维素含量高达35.8%。可通过化学或生物学方法处理使秸秆中的果胶、木质素、半纤维素等降解，释放纤维素用于草浆生产。我国的禾草类木材原料制浆历史悠久，是世界非木材纤维造纸产量最多、经验最丰富的国家。禾草类制浆造纸在我国造纸业发展史上发挥了极其重要的作用，曾经达到纸浆产量的85%以上，构成了具有中国特色的传统造纸工业[1]。但传统的草浆生产工艺主要是采用碱等化学处理方法，产生大量“黑色”废液，严重污染环境，导致许多中小型造纸生产厂家被迫停产或关闭。因此，筛选高效降解秸秆木质素等非纤维素物质的菌种，应用于草浆造纸行业，将具有重要的经济价值和环保意义。

在自然界中只有白腐菌能彻底地降解木质素[2]。本研究以5株具有降解木质素的白腐类真菌为出发菌种，经过驯化、发酵麦秸粉，通过测定接种前后不同时间菌丝体降解麦秸中木质素、纤维素的速率和数量，筛选出1株具有较高降解麦秸木质素而较低降解纤维素的菌株，为生物造纸工业提供有效的木质素降解菌及发酵技术奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

试验原料：麦秸，从枝江江口农田获得，经晒干粉碎成麦秸粉备用；菌种：白腐真菌—侧耳菌(Pleurotusosteatus)，编号为P侧五、P金凤2-5、PAX3、P8101和P802，由四川省农业科学研究院王波先生馈赠。

PDA培养基：去皮马铃薯小块 200 g，蔗糖(或葡萄糖) 20 g，琼脂 20 g，自来水1 000 mL，分装于试管，0.1 MPa灭菌30 min，制成斜面。

驯化培养基：麦秸粉20 g、麦麸80 g，自来水130 g，pH6.0，分装10个250 mL三角瓶中，0.1 MPa灭菌30 min。

发酵培养基：过40目的麦秸粉100 g，自来水130 g，pH6.0，分装10个250 mL三角瓶中，0.1 MPa灭菌30 min。

1.2 方法

(1)斜面活化 将收集保藏的5个供试菌分别接种于PDA斜面上，在30 ℃恒温箱中培养2～7 d，如此活化2～3代。

(2)菌种驯化 将已活化的5个供试菌分别接种于驯化培养基上，在30 ℃下驯化3～5 代，备用。

(3)发酵筛选 将已驯化的5个供试菌分别接种于发酵培养基上，每个菌种6个重复，未接种的发酵培养基(0 d)作对照。在30 ℃下培养，于0、2、4、6、8、9、10 d各取样1 g烘干处理，测定木质素、纤维素含量，计算木质素解率[(总木质素含量-剩余木质素含量)/总木质素含量×100,%]。

(4) pH单因素试验 将发酵培养基的pH调成为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，接种筛选的具有高效降解木质素而不降解或低降解纤维素的菌种，每个pH设3个重复， 30 ℃下培养8 d后，取样测定木质素剩余含量，计算木质素解率(%)。

(5)温度单因素试验 接种所筛选的具有高效降解木质素而不降解或低降解纤维素的菌种于发酵培养基中，分别放入28.0、29.3、30.4 ℃和31.2 ℃的恒温条件下培养8 d后，取样，测定木质素剩余量，计算木质素解率(%)。

(6)测定方法 按照文献[3～5]方法进行。纤维素的含量测定：硝酸、乙醇混合液回流提取法。即使木质素变为硝化木质素和氧化木质素溶入乙醇，半纤维素被水解、氧化，剩下的则为硝酸乙醇纤维素的含量。木质素的含量测定：用72%硫酸水解，经苯-乙醇抽提原料或培养料，使其中的非木质素成分经与硫酸作用而溶解，剩下的残渣即为粗木质素的含量。

(7)纤维素、木质素含量计算 草类原料中纤维素含量W1、木质素的含量W2，按下式计算：

W1(%)={(m1-m2)/[m0×(100-W0)/100]}×100。

式中,m0为试样的质量(g)；m1为玻璃滤器中烘干后残渣的质量(g)；m2为瓷坩埚中灰分的质量(g)；W0为试样中水分的含量(%)。

W2(%)={(m3-m4)/[m0×(100-W0)/100]}×100。

式中,m0为试样的质量(g)；m3为玻璃滤器中烘干后残渣的质量(g)；m4为瓷坩埚中灰分的质量(g)；W0为试样中水分的含量(%)。

2 结果与分析

2.1 麦秸粉的基本成分

将麦秸粉原料经处理后，测定水分、木质素和纤维素的含量，结果为麦秸粉含水量12.10%，木质素含量为22.64%，纤维素含量为39.60%。

表1 5个侧耳菌株对麦秸粉木质素的降解率Table 1 The degradation rate of the lignin in wheat strawby five Pleurotus strains %

表2 5个侧耳菌株对麦秸粉纤维素的降解率Table 2 The degradation rate of the cellulose inwheat straw by five Pleurotus strains

2.2 优良菌种的筛选

将经活化、驯化的5个侧耳菌株分别接种于发酵培养基中，在30 ℃恒温箱培养，于2、4、6、8、9、10 d取样测定木质素的含量，计算木质素的降解率，结果如表1。结果表明，发酵6～10 d，P802对麦秸粉木质素的降解率一直是最高的，且生长较快而壮；表2为发酵10 d纤维素的含量，结果显示P802对麦秸粉纤维素的降解率最低(8.08%)，菌丝生长快而密。结合菌丝的生长优势和降解率，故P802为所筛选的具有较高的降解麦秸木质素而低降解纤维素的优良菌株。

2.3 pH对木质素降解的影响

将P802菌株分别接种于pH为4.0～6.0的发酵培养基中，在30 ℃培养10 d，取样测定木质素的含量并计算其降解率，每个样品3个重复，结果如表3。P802在pH为4.0～4.5的环境下降解木质素剩余的含量最低，降解率最高，且菌丝生长快、壮实。真菌适宜生长在pH中性偏酸的条件，将pH降低于4.0以下，P802菌丝生长受影响，生长缓慢。故pH 4.0～4.5为P802解木质素的适宜条件。

表3 P802菌株在不同pH环境下对木质素的降解率Table 3 The degradation rate of the lignin in wheatstraw at different pH by the strain P802

表4 P802菌株在不同温度下对木质素的降解率Table 4 The degradation rate of the lignin in wheatstraw at different temperature by the strain P802

2.4 温度对木质素降解的影响

将P802菌株接种于发酵培养基中，分别放在28、29、30 ℃和31 ℃恒温箱培养10 d，取样测定木质素的含量并计算其降解率，每个样品3个重复，结果如表4。在30 ℃下，P802菌株对麦秸粉木质素的降解率最高。

3 讨论

本试验利用白腐真菌降解麦秸木质素，是在实验室三角瓶内进行的，高压灭菌对降解原料中的木质素是有一定作用的，所以实际值还应扣除这一因子的影响。试验中P802菌株发酵麦秸10 d后木质素的剩余量仍有13.94 g，这一值大于等于我国对可漂浆(指木质素在6%以下)的本色硬浆的硬度。所以，生物发酵法制草浆还是任重而道远的。

[1]李忠正．合理利用禾草类纤维造纸的理论与实践[J]．江苏造纸，2007，(1)：2～8.

[2]Kirk T K, Farrell R L.Enzymatic “combustion”：the microbial degradation of lignin[J].Annu Rev Microbiol, 1987, 41:465～505.

[3]李与文，王慧丽．制浆造纸分析检验[M]．北京：化学工业出版社，2005.3.

[4]薛惠琴，杭怡琼．稻草秸秆中木质素、纤维素测定方法的研究[J]．上海畜牧兽医通讯，2001，(2)：15.

[5]熊素敏，左秀凤，朱永义．稻壳中纤维素、半纤维素和木质素的测定[J]．粮食与饲料工业，2005，(8)：40～41.

2009-03-16

马立安(1964-)，女，湖北洪湖人，工学博士，副教授，主要从微生物学及分子生物学教学与研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.017

X172

A

1673-1409(2009)03-S053-03