应用酶联免疫法快速检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留

姜侃，陈宇鹏，金燕飞，黄建锋，陈小珍，张东雷

（1.浙江省质量技术监督检测研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

应用酶联免疫法快速检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留

姜侃1，陈宇鹏2，金燕飞1，黄建锋1，陈小珍1，张东雷1

（1.浙江省质量技术监督检测研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

建立乳品中β-内酰胺类抗生素残留酶联免疫快速检测方法。应用氨苄青霉素抗体，通过人工制备了氨苄青霉素（Amp）和辣根过氧化物酶（HRP）的结合物Amp-HRP，建立直接ELisa竞争法检测β-内酰胺类抗生素，确定了各种β-内酰胺类抗生素的检出限，并对检测条件进行了优化。检测了已知阴性和阳性的生鲜牛乳样品，结果表明对于阴性和阳性牛奶样品的检测未出现假阳性或者假阴性结果。该方法检测结果准确可靠，可广泛应用于检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留的检测。

乳品；β-内酰胺类抗生素；残留；酶联免疫；竞争法

0 引 言

随着生活水平的不断提高，人们对食品安全要求更高，但青霉素等β-内酰胺类抗生素的大量使用导致许多动物源性食品，尤其是乳制品存在安全隐患[1]。β-内酰胺类抗生素的检测方法中，理化检测方法占主导地位，其中液相色谱-质谱联用法因其高灵敏度、高选择性，在药物残留检测中的应用日趋普遍。但受设备要求高、操作复杂、检测成本高等因素限制，无法得到广泛应用。Elisa方法由于其灵敏度高、操作简便快捷、分析成本低、前处理简化、仪器化程度低、通量高等优点，在食品成分分析中应用前景佳。本研究采用Elisa法测定乳品中β-内酰胺类抗生素的残留，并对Elisa检测条件进行了优化，取得了满意的效果，为探究快速检测抗生素残留的方法打下良好的技术基础。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

酶标板，酶标仪，高速冷冻离心机，Amicon Ultra-4超滤管；氨苄青霉素抗体（Ampicillin Antibody，Amp-Ab），氨苄青霉素（Ampicillin），氨苄青霉素钠（Ampicillin-Na），庆大霉素（Gentamicin），青霉素-G（Penicillin G），阿莫西林 （Amoxicillin），苯唑青霉素（Oxacillin），替卡西林（Ticarcillin），四环素（Tetracycline），链霉素（Streptomycin），氯霉素（Chloramphenicol），辣根过氧化物酶（HRP），氰尿酰氯（CC），四甲基联苯胺（TMB）。

1.2 Ampicillin-HRP结合物的制备

[3-5]中的方法制备Amp-HRP结合物。具体操作步骤：①称取0.5mg的CC于离心管中，加入0.1mL丙酮后振荡溶解，室温下待丙酮完全蒸发后加入0.8 mL的HRP溶液（质量浓度为6 g/L，缓冲液浓度为0.05 mol/L,pH值为9.4的CBS溶液），室温下反应2 h，将反应产物对浓度为0.05 mol/L（pH值为9.4）的CBS缓冲液4℃下透析过夜，其间换液1次。②将上述透析产物吸入离心管中，加入125 μL的Amp溶液（质量浓度为10 g/L，缓冲液浓度为0.05 mol/L，pH值为9.4的CBS溶液），37℃反应5 h，加入少量赖氨酸终止反应，将反应产物对浓度为0.015 mol/L（pH值为7.2）PBS缓冲液4℃下透析过夜，其间换液1次。③将透析产物用Amicon Ultra-4超滤管在高速冷冻离心机中超滤1次，去除游离Amp，超滤产物在-80℃保存备用。

1.3 Amp-Ab最佳包被浓度的选择

采用方阵滴定法，用包被液将Amp-Ab稀释成1，2，4，6，10 mg/L五种质量浓度；100 μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；质量分数为0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤1次，加入200 μL质量分数为10%小牛血清，37℃封闭1 h；PBST洗涤3次，加入50 μL阴性和阳性的Amp标准品，再加入50 μL以1︰2500，1︰5000，1︰7500以及1︰10000稀释的Amp-HRP，37℃温育30 min；PBST洗涤5次，加入100 μL的TMB底物，室温显色15 min；用浓度为2 mol/L的HCl终止反应，再用酶标仪测定OD450，选择最佳包被浓度。

1.4 Amp-Ab最佳包被条件的选择

用Amp-Ab最佳包被浓度包板，按4℃和室温25℃过夜两种条件分别包被。将Amp-HRP以最佳稀释度稀释，用直接竞争Elisa法测定。

1.5 标准曲线的绘制及灵敏度计算

Amp-Ab用最佳包被浓度以及最佳包被条件包板，在质量分数为10%牛血清和空白生鲜牛乳样本中分别配制氨苄青霉素钠、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林标准溶液，并在0，1，2，3，4，5，10，50，100，200 μg/L质量浓度下应用，Amp-HRP以最佳稀释度稀释，由竞争Elisa得到数据，每个测试做4孔平行，以专业数据处理软件RIDAWIN处理数据分别绘制氨苄青霉素钠、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林等β-内酰胺类抗生素的标准曲线。参考相关文献，抑制率达到10%的质量浓度为该种β-内酰胺类抗生素最低检测限，抑制率达50%时的质量浓度比值为交叉反应率[6]。

1.6 非β-内酰胺类抗生素交叉反应率统计

在10%牛血清和空白生鲜牛乳样本中分别配制质量浓度为1000 μg/L的庆大霉素、四环素、链霉素和氯霉素溶液。在β-内酰胺类抗生素中进行检测分析，分析该检测系统与非β-内酰胺类抗生素的交叉反应率。

1.7 定量分析乳品中的β-内酰胺类抗生素

用本β-内酰胺Elisa试剂盒检测已知阴性生鲜牛乳样品（样品1～5）及已知含有相应质量浓度氨苄青霉素的生鲜牛乳样品（样品6～10）。具体操作：以抗生素检测阴性的生鲜牛乳为基质，添加氨苄青霉素标准品配制成含不同质量浓度氨苄青霉素的生鲜牛乳，质量浓度分别为2，3，4，20，35 ng/mL； 由竞争Elisa获得数据，每个测试做4孔平行，以专业数据处理软件RIDAWIN处理数据。

2 结 果

2.1 Amp-HRP结合物的制备

Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外扫描结果如图1所示。由图1可以看出，反应前Amp的特征吸收峰为206 nm左右，HRP的特征吸收峰为214 nm左右，结合反应后Amp-HRP的特征吸收峰为221 nm左右，因此Amp-HRP具有Amp和HRP吸收峰的重叠，根据UV的加和性[5]可知，Amp-HRP结合成功。

图1 Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外扫描结果

2.2 Amp-Ab最佳包被质量浓度的选择

不同包被质量浓度的Amp-Ab和不同稀释度的Amp-HRP作方阵滴定后的OD值如表1所示。由表1可以看出，在OD值接近1.0，N/P值在1.5以上并呈现最大者的包被质量浓度为6 mg/L，Amp-HRP的最佳稀释度为1︰7500。

表1 Amp-Ab和Amp-HRP方阵滴定的OD值

2.3 Randox Ab最佳包被条件的选择

Randox Ab在4℃和室温25℃两种条件下包板后，采用竞争Elisa测定的OD值，结果如表2所示。由表2可以看出，阴性信号较高，且N/P值比较大的最佳包被条件为4℃包被过夜。

2.4 氨苄青霉素免疫竞争法标准曲线的建立

Amp-Ab用最佳包被质量浓度（6 mg/L）以及最佳包被条件（4℃过夜）包板，Amp-HRP以1︰7500稀释，直接竞争免疫反应后分别获得以质量分数10%牛血清和空白生鲜牛乳为基质的标准品的检测数据，如表3和表4所示；绘制的标准曲线由图2和图3所示。

表2 不同包被条件竞争Elisa检测OD值

表3 以10%牛血清为基质的氨苄青霉素标准品检测数据

表4 以生鲜牛乳为基质的氨苄青霉素标准品检测数据

图2 以10%牛血清为基质的检测标准曲线

从标准曲线数据分析，当以质量分数为10%牛血清为基质时，抑制率达到10%时需要的氨苄青霉素的质量浓度为0.6 μg/L，即检测限为0.6 μg/L；当以生鲜牛乳为基质时，抑制率达到10%时需要的氨苄青霉素的质量浓度为1.1 μg/L，即检测限为1.1 μg/L。

图3 以生鲜牛乳为基质的检测标准曲线

从变异系数分析，当抗生素浓度处于相对较低或较高情况时，系统变异系数相对较高，提示已经接近该系统的检测线性范围。虽然在标准曲线各浓度点与实测浓度存在一定偏离度，但该系统检测标准曲线线性良好，相关系数在99%以上，符合检测要求。

2.5 其他β-内酰胺类抗生素检测限及交叉反应率计算

以2.4所述方法，分别以质量分数为10%牛血清和生鲜牛乳绘制青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素和替卡西林检测标准曲线并确定检出限和交叉反应率。具体结果详如表5所示。

表5 几种β-内酰胺类抗生素检出限

本实验所尝试的其他4种β-内酰胺类抗生素中，阿莫西林的交叉反应率最高，以质量分数为10%牛血清为基质时，交叉反应率高达86%；青霉素-G次之，以质量分数为10%牛血清为基质时，交叉反应率高达79%。因此，该检测系统可作为β-内酰胺类抗生素的检测系统。

2.6 定量分析模拟样品及真实生鲜牛乳

对20种已知标示值的牛奶样品采用通用免疫竞争法进行分析，结果见表5。表5中的结果证实，该免疫分析法可成功地用于检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素，已知阴性的牛奶经该法确认为阴性，已知阳性的牛奶经该法确认为阳性，进一步证实本实验所建立的通用免疫竞争法可用于定量检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素。

3 结果与讨论

β-内酰胺类抗生素是指具有β-内酰胺环的一类抗生素，在奶牛养殖业中常用于医治奶牛的乳腺炎，因其广谱性及其低廉的价格，常被频繁地、超剂量地使用。残留了抗生素的牛奶，被人饮用后，会导致不良反应。

表5 牛奶样品1-20的检测结果

目前牛奶中抗生素的检测主要有以下几种方法：① 微生物检测法，如纸片法（PD）[7]、TTC法[8]等。 微生物检测方法价格低，但操作复杂，检测周期长，显色状态判断易产生误差。②理化检验法[9]，如高效液相色谱法及与质谱联用法、薄层层析法、离子对色谱法、毛细管电泳法、比色法、荧光分光光度法等，但检测程序较复杂，需专业的技术人员操作，且检测成本较高，难以适应基层对牛奶抗生素检测的需要。③免疫分析法[10]的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原一抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。免疫学检测方法是目前公认的比较特异、灵敏的方法，而且其操作简便，快速，越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测。

本研究以氨苄青霉素抗体为基础，人工制备了氨苄青霉素和辣根过氧化物酶的结合物Amp-HRP，建立直接ELisa竞争法检测β-内酰胺类抗生素。该检测方法优点有三：①检测灵敏度高，当以生鲜牛乳为基质时，常用β-内酰胺类抗生素中氨苄青霉素和青霉素-G检测限分别可达1.1和2.4 μg/L；② 特异性强，与非β-内酰胺类抗生素无交叉反应；③操作简便，乳品样本无需前处理，可直接应用于检测，大大缩短检测周期，提高实验效率。

因此，该检测系统可广泛应用于我国各奶牛场、乳品企业以及食品安全监控机构等对牛奶中β-内酰胺类药物残留的快速筛选与检测。

参考文献：

[1]EVA G,PETER B,ASE S.Biosensor Nnalysis of Penicillin G in Milk Based on the Inhibition of Carboxypeptidase Activity[J].Analytica Chimica Acta,2002,468：153-159.

[2]中华人民共和国农业行业标准 《无公害食品 生鲜牛乳》（NY5045—2008）[S].北京：中国标准出版社,2008.

[3]FRANK J S,PATRICK S C.Chromatographic Methods of Analysis of Antibiotics in Milk[J].Journal of Chromatography A,1998,812：99-109.

[4]RAMADAN A A,CONNIE Y L,HANNAH H M G,et al.Efficient Labelling of Antibodies with Horseradish Peroxidase Using Cyanuric Chloride[J].Journal of Immunological Methods,2005,306：211-217.

[5]黄丽.抗AMP单抗的制备及牛奶中AMP残留ELISA检测方法的建立[D].南昌大学,2007.

[6]张建群，刘翔，杨扬.Elisa法测定氨苄青霉素用多克隆抗体的制备和鉴定[J].中国食品学报,2006,6：11-19.

[7]OUDERKIRK L A.Detection of Residual Penicillins in Milk by Using a Bacillus Stearothermophilus Disk Assay[J].J Assoc of Anal Chem,1977,60：1116-1118.

[8]中华人民共和国国家标准 《食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留量检验》（GB/T 4789.27-2008）[S].北京：中国标准出版社,2009.

[9]章银良,伍季,鲍彤华.牛奶中抗生素残留检测方法的研究现状[J].郑州轻工业学院学报（自然科学版）,2006,21：21-25.

[10]JIN Y,JANG J W,LEE M H.Development of ELISA and Immunoehromatographic Assay for the Detection of Neomycin[J].Clin Chim Acta,2006,364：260-266.

Application of enzyme-linked immunosorbent assay in detecting β-lactam antibiotic residues in dairy products

JIANG Kan1，CHEN Yu-peng2，JIN Yan-fei1，HUANG Jian-feng1，CHEN Xiao-zhen1，ZHANG Dong-lei1
（1.Zhejiang Test Academy of Quality and Technical Supervision,Hangzhou,310013,China;2.BIOER Technology CO.,LTD,Hangzhou,310053,China;）

Competitive enzyme-linked immunosorbent assay was use for developing a β-lactam antibiotics rapid detection method.The conjugate of ampicillin and HRP was synthesized,and direct competitive Elisa based on β-lactam antibiotics was set up and optimized.The detection limit of β-lactam antibiotics was also identified.Detection of the known negative and positive samples of raw milk showed that no false positive or false negative results appear.This method is accurate and reliable,and can be widely applied to detect β-lactam antibiotic residues.of dairy products.

dairy;β-lactam antibiotics;residues;competitive elisa

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0051-04

2009-08-20

浙江省质量技术监督系统科研计划项目（20080104）。

姜侃（1978-），男，工程师，研究方向为免疫学与微生物学。

张东雷