栉孔扇贝D形幼虫血细胞发生特点的研究*

李子牛,邢 婧,林听听,战文斌

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003)

栉孔扇贝D形幼虫血细胞发生特点的研究*

李子牛,邢 婧,林听听,战文斌**

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003)

研究组前期实验表明,栉孔扇贝(Chlamys f arreri)从囊胚期开始的各发育时期中,以D形幼虫期开始出现形态可辨的血细胞。本文采用石蜡切片、组织化学、栉孔扇贝血细胞单克隆抗体的免疫组化方法,定位、观察栉孔扇贝D形幼虫血细胞的分布和形态特点。结果表明:可辨形态的血细胞集中分布于幼虫的外套膜、面盘、口、食道、胃、消化腺、肠等组织,游离的血细胞大多为球形或椭球形,直径约为1～3μm,中央有一深色细胞核,而在消化腺中血细胞密集层叠,形态各异。在该时期未观察到不同类型的血细胞和造血组织。结论认为,D形幼虫期开始出现形态可辨的血细胞,主要分布于与摄食消化相关的组织器官内。

栉孔扇贝;D形幼虫;血细胞;单克隆抗体

贝类不具有特异性免疫,对宿主免疫防御主要是通过血细胞为主的细胞免疫反应辅以体液因子参与的体液免疫反应清除外来病原和异物,因此,血细胞在贝类免疫防御机制中起着重要作用[1]。血细胞在贝类全身各处循环分布,行使吞噬、创伤修复、营养等功能,并通过分泌各种非特异性体液因子完成宿主的免疫防御反应[2,3],但是贝类血细胞不能进行有丝分裂,其补充和更新主要依靠造血组织完成[4]。有关贝类血细胞的形态、分类、细胞化学、体液因子活性、免疫功能等的研究已有诸多报道[5-9],但关于贝类血细胞发生和发育的研究相对较少。Dyrynda等应用单克隆抗体对贻贝(Mytilus edulis)胚胎幼体的血细胞研究中发现,在第1～4 d和第11 d的幼虫与抗体反应并呈强阳性,但并没有详细的形态描述[10]。本研究组前期研究发现栉孔扇贝(Chlamys f arreni)稚贝的造血组织定位在闭壳肌附近[11]。最近采样栉孔扇贝从受精卵开始的各发育时期的幼虫,通过抗栉孔扇贝单克隆抗体跟踪定位血细胞的发生发育情况(另文发表),发现在D形幼虫期开始出现形态可辨的血细胞。本文采用石蜡切片、组织化学法、栉孔扇贝血细胞单克隆抗体的免疫组化方法,定位、观察栉孔扇贝D形幼虫血细胞的分布和形态特点等,以期为研究和阐明扇贝血细胞的发生、分化和成熟过程提供资料。

图1 抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体2C6的免疫细胞化学结果Fig.1 Haemocytes ofC.f arrerirecognized by Mab 2C6 using immunohistochemical staining

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

栉孔扇贝(C.f arreri)D形幼虫样品采集于文登市水产综合育苗试验基地,为孵化后第1～4 d幼虫,镜检其幼虫全长约为(140±10)μm。

鼠抗栉孔扇贝血细胞的单克隆抗体2C6由中国海洋大学免疫与病害实验室制备[12],经免疫细胞化学法、流式细胞仪和Western-blotting分析其特性,证明这株单克隆抗体具有抗栉孔扇贝血细胞的特异性,抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体的免疫细胞化学结果见图1。

生物素化马抗小鼠IgG(H+L)、碱性磷酸酶(AP)标记链亲和素、碱性磷酸酶底物AP-Red试剂盒(sigma公司)购自北京中杉金桥生物公司,牛血清白蛋白(BSA)购自AMRESCO公司,3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)购自sigma公司。

1.2 方法

幼虫样品的处理 幼虫放入Bouin’s液中固定12 h后移入70%酒精中保存。固定后幼体以500目筛绢包裹脱水透明,以石蜡包埋。

组织切片 将石蜡包埋的扇贝D形幼虫连续切片厚度5μm。将玻片置于烘箱中37℃过夜,二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后晾干切片表面水分,放入-20℃冰箱中备用。切片所用的载玻片预先用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理。

H&E染色 取出一部分石蜡切片进行苏木精-曙红染色,梯度乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片,O-lympus显微镜观察,拍照。

免疫组化 取出一部分石蜡切片,加3%醋酸,室温孵育10 min,以阻断扇贝组织内源酶的活性,然后用含0.1%tween-20的0.01 mol磷酸盐缓冲液(PBST,p H=7.4)浸洗5 min。将切片放入p H=6.0柠檬酸缓冲液中,在120℃的高压锅中放置7 min进行抗原修复,取出后用PBST浸洗5 min;加3%的牛血清白蛋白孵育30 min封闭;PBST浸洗3次,每次5 min;加第一抗体-鼠抗栉孔扇贝血细胞的单克隆抗体2C6,37℃孵育1 h,PBST浸洗3次,每次5 min;之后,加生物素化马抗小鼠IgG(稀释比例1∶2 000),37℃孵育45 min,PBST浸洗3次,每次5 min;然后加碱性磷酸酶(AP)标记链亲和素(稀释比例1∶500),37℃孵育45 min,PBST浸洗3次,每次5 min。最后,以碱性磷酸酶底物AP-Red试剂盒底物发色5 min,自来水冲洗,苏木素复染1 min,0.1%的HCl分色,自来水冲洗,蓝化,50%缓冲甘油封片,Olympus显微镜观察,拍照。阴性对照用骨髓瘤细胞(P3U1)培养液上清代替抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体为第一抗体。

2 结果

2.1 光镜和组织化学观察

在光镜下观察,栉孔扇贝D形幼虫呈黄褐色,体外覆盖1层薄的壳,壳长约为(140±10)μm,壳呈“D”字形,贝壳透明,可见壳内中央部位的内脏团(见图2A小图版)。幼虫贝壳张开时可见椭圆形的面盘伸出,面盘周围上生长许多纤毛,使其能在水中游动和摄食,面盘也可收缩于壳内。在幼虫内脏团中央为胃,其内可见吞食的绿色藻类,内脏团背后方有足(见图2A)。

石蜡切片经H&E染色后观察发现,栉孔扇贝D形幼虫已经开始具有分化清晰的组织器官。包括:外套膜、面盘、口、食道、胃、肠、足。幼虫虫体被1层薄的外套膜包裹,面盘收缩于外套膜内,面盘表面长有1层纤毛,面盘一侧有口,口周围也附有纤毛,口与幼体的食道连接至膨大的胃部,食道周围附有膨大的消化腺,胃之后紧接肠道以及肛门。在面盘的下部,消化腺的左侧有足(见图2B)。H&E染色仍能看见胃中的食物。幼体食道、消化腺、胃等处均有大量细胞聚集,H&E染色为深蓝色,形态类似血细胞。在外套膜、口、食道和胃边缘处分布的血细胞呈游离状,血细胞呈球形或椭球形,直径约为1～3μm,属于外周循环血细胞。在消化腺中,血细胞高度密集形态各异,成簇分布,可能与幼虫旺盛的捕食、消化功能相适应。

2.2 免疫组化观察

石蜡切片经单克隆抗体的免疫组化实验后,阳性信号(红色的沉淀)出现在幼体组织和细胞的内部,说明D形幼虫体内已经出现了大量血细胞。阳性信号分散地出现于幼虫的外套膜边缘帆状部分,面盘的纤毛根部,胃和食道壁的上皮组织内,说明在外套膜边缘面盘和消化道壁内的上皮组织内均匀地分布着游离的血细胞(见图2C)。血细胞为球形或椭球形,直径约为1～3μm,中央有一深色细胞核。消化腺中由于血细胞成簇存在,大量聚集,阳性信号密度高且呈簇出现。无法清晰地观察到血细胞的内部形态(见图2C放大图版)。阴性对照显示无任何阳性信号出现(见图2D)。

图2 栉孔扇见D形幼虫形态及血细胞分布Fig.2 The morphology and haemocyte localization of D lovivae inC.f arreni

3 讨论

本文通过光镜观察、H&E染色、单克隆抗体的免疫组化方法研究栉孔扇贝D形幼虫体内血细胞的分布特点,结果显示,D形幼虫体内出现形态分化的组织器官,包括外套膜、面盘、口、胃、食道、消化腺、肠、足等。血细胞分布于幼虫的外套膜、面盘、口、胃、食道等的上皮组织内,血细胞呈游离状态分布,为球形或椭球形,直径约为1～3μm,中央有一深色细胞核。另外,血细胞在消化腺内大量聚集,免疫组化结果呈强阳性。

本研究组在前期研究过程中,采集了栉孔扇贝各个发育时期的样品,包括:囊胚期、原肠期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、稚贝,对样品进行前期的实验研究发现在原肠期、单轮幼虫时期均出现了阳性信号(另文发表),但因为这些时期幼虫的组织细胞并没有完全分化,单抗反应呈阳性的细胞与其周围的细胞区分不开,不能够分辨细胞的形态和结构。然而从D形幼虫开始组织器官明显分化[13],出现了分化出的胃、食道、消化腺、肠、足等组织,游离状态的血细胞可见于该组织中。免疫组化的阳性信号(红色)也开始增强增多,在消化腺、食道等处出现呈团聚集和游离的血细胞。Dyrynda等的研究结果表明,抗贻贝(M.edulis)血细胞的单克隆抗体与1～4 d的幼反应,出现了阳性信号,本文这一结果与Dyrynda等的结果一致[10]。D形幼虫的组织器官有了明显分化,行使不同的功能,需要有循环的血细胞传递和转运营养物质,行使免疫防御等功能。在D形幼虫中,血细胞发挥着重要的作用,因此,本研究选取D形时期的幼虫为研究对象,对其血细胞发生的形态和抗原特点进行研究。

通常在免疫组化实验中,为了保存抗原性大多使用冰冻切片方法,但该方法不能很好的还原样品的形态和结构。本文采用石蜡切片,经高压方法进行抗原修复,保证了样品抗原性的恢复,再进行免疫组化,结果表明,该方法使样品保持了较完整的形态和抗原性,该方法为扇贝血细胞发生发育的研究提供了技术基础。

在本研究前期实验中,选取了本研究组研制的单克隆抗体1E7、1F12、2C6、2H5这4株抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体定位观察扇贝幼虫血细胞,研究结果表明不同抗体出现阳性信号的时期不同,大部分单克隆抗体都在D形幼虫期才出现阳性信号,且阳性信号较弱。只有单抗2C6在原肠期起出现阳性信号,并随着幼虫的发育而阳性型号增强增多。究其原因,可能在栉孔扇贝早期发育时期还未出现与1E7、1F12、2H5这3株抗体相关的血细胞的抗原决定簇,抑或血细胞还没有完全分化成熟,这3株单克隆抗体还不能够与之结合。此外,在成体扇贝中,观察到的血细胞大多为游离状态,分布于外套膜、闭壳肌、鳃、消化腺、胃、肠,等组织器官内,在造血组织内,血细胞高度聚集,层叠增生,通过管道与闭壳肌相连输送成熟的血细胞入围心腔。在D形幼虫期,部分血细胞游离分布于幼虫的外套膜边缘帆状部分,面盘的纤毛根部,胃和食道壁的上皮组织内,或者聚集于消化腺中,以上器官或组织都与扇贝的摄食、消化功能相关。而在成体扇贝中,血细胞分化为颗粒或透明细胞,并通过吞噬、胞吐、聚集、营养、运输等作用参与免疫防御、摄食消化等,比D形幼虫的血细胞所发挥的功能要强大得多。可见,D形幼虫时期的血细胞还未进行更为专业的分化,至于D形幼虫血细胞中分化出颗粒细胞和透明细胞,本研究组将通过不同类型血细胞的单克隆抗体定位不同时期幼虫的血细胞进行深入研究。

根据文献报道,栉孔扇贝的稚贝和成贝,有3个大型的静脉窦,第1个静脉窦位于消化腺和围心腔膜的下面,与两侧的左右肾相通;其余2个静脉窦位于闭壳肌腹缘的左右侧,闭壳肌侧的囊状组织为其血细胞的发生器官[4]。本文研究发现:幼虫的循环系统为开放式,成形的血细胞存在于D形幼虫的与摄食消化相关的组织器官(外套膜、面盘、口、食道、胃、肠、消化腺)中,这可能与血细胞具有运输和消化营养物质的功能有关。陈蜀娜等[14]在河蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜钙的组织化学定位及运输途径的研究中以及胡曦璇等[15]在背角无齿蚌(A nodonta woodiana)珍珠囊形成过程中钙代谢的研究中都发现血细胞具有运输Ca2+的能力。但本文并未发现像稚贝或成体扇贝高度集中的造血组织或血细胞发生组织。可能造血组织还没有完全分化出来或者已经包埋于消化腺等组织器官之中,有待进一步研究。

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Localization and Distribution of Haemocytes in D Larvae of Scallop Chlamys farreri

LI Zi-Niu,XIN GJing,LING Ting-Ting,ZHAN Wen-Bin
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Preliminary data showed that,during the development of Chinese scallopChlamys f arreri,distinguishable haemocytes occurred since the stage of D larvae.In this paper,the study on the distribution and morpha of haemocytes in D larvae were carried out by the methods of light microscopy,histochemical staining and immunohistochemistry(IHC)with monoclonal antibodies against haemocytes ofC.f arreri.The results showed that the haemocytes with distinguishable morpha were mainly distributed in the tissues of mantle,velum,mouth,esophagus,stomach,digestive gland and intestine.Moreover,the dissociative haemocytes with a fuscous nuclear in center were spherical or spheroidical,with a diameter of 1～3μm,and assembled in digestive gland.However,the different types of haemocytes and the hematopoietic tissues were not found in D larvae stage.So,as a conclussion,we deduced that the haemocytes became morphologically distinguishable from D larvae stage and mainly distributed in tissues and organs which are related to feeding and digestion.

Chlamys f arreri;D larvae;haemocyte;monoclonal antibody

S917

A

1672-5174(2010)09-061-05

国家高技术研究发展计划项目(2006AA100307);国家自然科学基金项目(30901112)资助

2009-11-09;

2010-04-27

李子牛(1985-),男,硕士生,主要从贝类免疫学研究.E-mail:ironbullan@yahoo.com.cn

**通讯作者:Tel:0532-82032284;E-mail:wbzhan@ouc.edu.cn

责任编辑 于 卫