海洋中海藻糖产生菌的筛选及发酵条件优化

赵玉巧,仲美荣,顾玲玲,类登昌

(淮海工学院海洋学院,江苏连云港 222005)

海藻糖是由2个葡萄糖分子组成的1个非还原性双糖[1],它有3种异构体,分别是α、α-海藻糖、α、β-海藻糖和β,β-海藻糖,天然存在的异构体是α,α型海藻糖[2],广泛存在于各种生物体中,包括细菌、酵母、真菌和藻类以及一些昆虫、无脊椎动物和植物中。它不仅是作为一种碳水化合物类的能源物质,还可防御如高温、冷冻、脱水和高渗透压等不利环境因素,该特性已被广泛运用于食品、化妆品、医药等行业[3]。海藻糖的生产方法较多,有微生物抽提法、从发酵液中提取、酶转化法和基因重组法[4],目前海藻糖的生产方法主要为从发酵液中提取和酶转化法,由于海藻糖提取与纯化步骤的复杂性,当海藻糖的含量小于原料干重的15%时不适合产业化规模生产[5]。本文研究从海洋中筛选出高产海藻糖菌株,并对菌株培养条件进行优化,以期降低海藻糖的生产成本,使菌株具有一定的工业应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 从连云港近海海域采集的新鲜海水、海泥及海洋鱼贝类中分离筛选产生海藻糖的菌株,并进行编号。

1.1.2 培养基 ①液体富集培养基：葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,KH2PO45g,MgSO4·7H2O 2 g,链霉素30 mg,补煮沸过滤陈海水至1 000 mL,pH 6.3～6.5;②平板富集培养基：蔗糖15 g,葡萄糖5 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,KH2PO45 g,MgSO4·7H2O 2 g,链霉素30 mg,琼脂20 g,补煮沸过滤陈海水至1 000 mL,pH 6.3～6.5;③PDA培养基：马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂20 g,补煮沸过滤陈海水至1 000 mL,pH自然;④发酵培养基：蔗糖31 g,酵母膏9.9 g,蛋白胨9.9 g,NH4Cl 2.2 g,KH2PO40.4 g,Na2HPO40.4 g,MgSO40.2 g,CaCl20.2 g,FeCl30.2 g,补煮沸过滤陈海水至1 000 mL,pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌株的分离及产海藻糖菌株的初筛

海水样品在5 000 r/min离心15 min得海水沉淀物(海泥取适量,海洋鱼贝类取内脏),接种到液体富集培养基中培养,培养条件为30℃,160 r/min 72 h。液体富集培养菌悬液在平板富集培养基上划线分离单菌落,培养条件为30℃48 h。将分离得到的单菌落接种到发酵培养基中,于摇床中160 r/min,30℃培养60 h,用纸层析法确定产海藻糖酵母100余株,编号后保存在PDA斜面培养基上。

1.2.2 产海藻糖菌株的复筛 将斜面保存的菌种分别接种到发酵培养基的三角瓶中,在30℃,160 r/min的摇床中培养24 h作为种子,在装有发酵培养基的三角瓶中按5%的接种量接入种子,在30℃,160 r/min的条件下,摇瓶培养60 h,取发酵液离心收集菌体测干重并测定海藻糖含量。

1.2.3 海藻糖产生菌2-14的形态特征及生理生化特征 对菌株进行假菌丝、子囊孢子、掷孢子、糖发酵、碳源同化、氮源同化、DBB、尿酶等实验[6-7]。

1.2.4 细胞生长量的测定 采用细胞干重法。

1.2.5 海藻糖的测定方法 ①纸层析法：展开剂为正丁醇：丙酮：水：醋酸=l0：3：6：2(体积比),显色剂A液：AgNO3的水-丙酮饱和溶液,水：丙酮=1：200(体积比);B液：将l gNaOH溶于100 g乙醇水溶液中,乙醇：水=1：1(质量比)[8];②硫酸-蒽酮法：见参考文献[9]。

1.2.6 发酵条件对海藻糖产生的影响 ①初始pH对红酵母产海藻糖的影响：分别选择初始pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0,其他发酵条件为：温度28℃,装液量为250 mL三角瓶装50 mL培养基,发酵时间60 h;②发酵温度对红酵母产海藻糖的影响：发酵温度选择22、25、28、30、37℃,初始pH 5.5,装液量为250 mL三角瓶装50 mL培养基,发酵时间60 h;③装液量对红酵母产海藻糖的影响：在250 mL三角瓶中装液量分别为25、50、75、100、125 mL,发酵温度28℃,初始pH5.5,发酵时间60 h;④菌体生长及海藻糖产生曲线：在5 L小型发酵罐中装3.5 L发酵培养基,恒28℃;pH 5.5左右,发酵时间60 h。

2 结果与讨论

2.1 产海藻糖酵母的筛选结果

对180余份海水及海泥等样品的初筛得到100余株产海藻糖菌株,对其中60余株海藻糖产量较高的菌株进行复筛,其中10株产量高的菌株复筛结果见图1。

图1 10株产海藻糖菌株摇瓶复筛结果Fig.1 The results of trehalose production from 10 strain

由图1可见,编号为2-14的菌株海藻糖含量最高,为127.9 mg/g cell,其次菌株3-12海藻糖含量为105.1 mg/g cell,这2株菌均有一定的应用价值。

2.2 菌株2-14的鉴定

2.2.1 形态特征 由图2可见,菌株2-14细胞呈圆形或椭圆形,其大小约为5.1～7.2μm,繁殖方式为芽殖,无假菌丝、子囊孢子及掷孢子形成。发酵液清,表面无醭、无环、无气泡、无沉淀。菌落饱满潮湿,颜色为红色,边缘整齐,无褶皱。

图2 菌株2-14的细胞形态Fig.2 The morphological character of strain 2-14

2.2.2 糖发酵试验 菌株2-14对乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、L-山梨糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、核糖、葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸均不发酵。

2.2.3 碳源同化试验 由于菌株2-14对糖、醇及酸均不发酵,选择14种碳源进行同化试验,结果见表1。由表1可见,该菌株不同化淀粉、乳糖、山梨糖及琥珀酸。

表1 菌株2-14碳源同化试验结果Table 1 The results of strain 2-14 on differents carbon sources

2.2.4 氮源同化试验结果 由表2可见,菌株2-14对所选择的5种氮源均同化。

表2 菌株2-14氮源同化试验结果Table 2 The results of strain 2-14 on differents nitrogen sources

2.2.5 其他生理生化试验 菌株2-14不液化明胶,脲酶阳性,葡萄糖氧化阴性,DBB阳性,类淀粉化合物形成结果为阴性,石蕊牛奶试验产碱,在37℃条件下能正常生长。根据菌株2-14的形态特征、培养特征及生理生化特征,该菌株与《酵母的特征与鉴定手册》中红酵母属(Rhodotorula)的分类特征最相符,所以初步鉴定菌株2-14为红酵母属。

2.3 初始pH对红酵母产海藻糖的影响

由图3可见,随着初始pH的增大,红酵母细胞中海藻糖产量快速增加,至初始pH 5.5时达到最高,当初始pH大于5.5时红酵母细胞中海藻糖产量则快速降低,红酵母细胞干重受初始pH的影响结果与产海藻糖的结果一致。上述结果说明该红酵母生长及海藻糖的积累均对初始pH敏感,在发酵过程中,应该严格控制初始pH以及发酵过程pH。

图3 pH对红酵母海藻糖产量的影响Fig.3 Effect of pH on trehalose production

2.4 发酵温度对红酵母产海藻糖的影响

由图4可以看出,随着温度的升高红酵母细胞干重及海藻糖产量均较快增加,均在28℃达到最高,当发酵温度为37℃时红酵母细胞的生长量仍较大,但该温度下细胞中海藻糖产量下降较多。

图4 温度对红酵母海藻糖产量的影响Fig.4 Effect of tempersture on trehalose production

2.5 装液量对红酵母产海藻糖的影响

由图5可以看出,虽然红酵母细胞干重及海藻糖产量的最高点均为装液量75 mL(250 mL三角瓶中),但装液量对该酵母生长的影响不太大,对海藻糖的产生影响却较明显。采用优化前发酵条件红酵母海藻糖产量为132.1 mg/g cell,由图5可知,装液量75 mL时红酵母海藻糖产量为193.3 mg/g cell,优化后的结果是优化前的1.46倍。

图5 装液量对红酵母海藻糖产量的影响Fig.5 Effect ofmedium on trehalose production

2.6 菌体生长及海藻糖产生曲线

红酵母在5 L发酵罐中发酵,结果见图6。由图6可见,发酵时间20 h前培养基中蔗糖浓度快速降低,随着蔗糖浓度的降低,细胞增殖较快并在20 h接近稳定期,细胞中海藻糖在20 h前有一定量的积累但不多。发酵时间20 h后,随着培养基中蔗糖的耗竭,细胞中海藻糖产量逐渐提高,至54 h达到最高,为190.3 mg/g cell,54 h后细胞中海藻糖产量快速下降,原因是培养基中蔗糖及其他成分的严重缺乏,使得细胞中的海藻糖水解酶开始水解海藻糖以维持细胞的活力。54 h时发酵液中海藻糖含量为2.50 g/L,由图5可知pH 5.5时摇瓶发酵液中海藻糖含量为1.52 g/L,发酵罐培养每升发酵液中海藻糖含量为摇瓶培养的1.6倍,确定54 h为最佳发酵时间。

图6 红藻酵母生长和海藻糖积累曲线Fig.6 Progress curves of cell growth and trehalose production

3 讨 论

由于大多数酵母在适当的条件下可产生海藻糖,故在筛选培养基中加入了链霉素,筛选出的菌株大多数为酵母,从其中产量较高的10株菌的海藻糖含量可以发现,从海洋中筛选产量较高的海藻糖产生菌比较容易。

根据菌株2-14的形态特征、培养特征及生理生化特征,依据《酵母的特征与鉴定手册》中有关酵母菌的分类特征,菌株2-14与红酵母属最相符,初步鉴定菌株2-14为红酵母属(Rhodotorula)。本实验采用传统的菌种分类鉴定方法,该方法工作量大,过程繁琐,尽管部分试验多次重复但还是不能排除个别试验结果的误差。

对红酵母摇瓶发酵条件试验发现,该酵母生长及海藻糖的积累均对初始pH敏感,原因可能是该红酵母中海藻糖合成酶的最适pH范围小,在pH 5.5附近。红酵母发酵温度高于28℃对细胞生长影响不大,但对红酵母产生海藻糖有较大的影响,可能与海藻糖对细胞的保护及海藻糖合成酶的最适温度有关。红酵母生长及积累海藻糖的最佳装液量均为75 mL(250 mL三角瓶中),说明该酵母对氧的需要量适中,这与大多数酵母对氧需要量相似。在5 L发酵罐中发酵的结果表明,该酵母在进入稳定生长期后海藻糖开始快速积累,特别是当蔗糖耗竭时海藻糖增长更快,说明该酵母碳源缺乏后可刺激海藻糖的产生。在发酵罐中培养虽然细胞中海藻糖含量没有提高,但细胞干重提高较多,达到13 g/L,而在摇瓶中细胞干重最高仅为8.6 g/L,可见在发酵罐中培养效果优于摇瓶培养。

[1] Tarek El-Bashiti,Haluk Hamamci,Huseyin A.oktem,et al.Biochemical analysis of thehalose and its metabolizing enzymes in wheat under abiotic stress conditions[J].Plant Science,2005,169：47-54.

[2] Attilio Cesaro,Ornela De Giacomo,Fabiana Sussich.Water interplay in trehalose polymorphism[J].Food Chemistry,2008,106：1318-1328.

[3] Youn Jeung Cho,Oh Jin Park,Hyun Jae Shin. Immobilization of thermostable trehalose synthase for the production of trehalose[J].Enzyme andMicrobial Technology,2006,39：108-113.

[4] 赵晓峰,吴荣书.海藻糖的功能特性及其应用[J〗.广州食品工业科技,2004,20(2)：151-154.

[5] Chiara Schiraldi,Isabella Di Lernia and Mario De Rosa.Trehalose Production：exploiting novel approaches[J].TRENDS in Biotechnology,2002,20(10)：420-425.

[6] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001：364-387.

[7] J.A.巴尼特著,亚罗,胡瑞卿译.酵母菌的特征与鉴定手册[M].青岛：青岛海洋大学出版社,1991：17-164.

[8] 王兰,肖冬光.纸层析分离洗脱法定量测定海藻糖[J].生物技术,2002,12(3)：27-29.

[9] 谭海刚,梅英杰,关凤梅,等.蒽酮-硫酸法测定酵母中海藻糖的含量[J].现代食品科技,2005,22(1)：125-128.