福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

杨希

(1.福建省林业科学研究院,福建福州 350012;2.国家林业局南方山地用材林培育重点实验室,福建福州 350012)

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

杨希1,2

(1.福建省林业科学研究院,福建福州 350012;2.国家林业局南方山地用材林培育重点实验室,福建福州 350012)

采用常规检测法 (贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为 4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008～2010年,松材线虫检出率分别为 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为 14.04%、16.03%和 0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂 1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达 100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。

松枯死木;检测鉴定方法;线虫;快速检测;福建

松材线虫病也称松树萎蔫病,是一种由松材线虫 (B ursaphelenchus xylophilusSteiner et Buhrer)引起,危害松树的毁灭性病害[1-5]。近几年,课题组对全省各地采集的松树枯死木样本,在检测鉴定是否为松材线虫所致的同时,探讨了松树枯死木中线虫种类、相互存在关系 (未见报道)和检出情况。同时,对部分松枯死木样本进行了快速检测研究,可为我省各地在松材线虫病监测时的取样、检测鉴定提供参考。

1 材料

1.1 试材来源

取自福建省内马尾松枯死木木段、圆盘、木块等,树龄 5～30a,胸径 2.8～52cm。指示剂 1号由国家林业局森林病虫害防治总站的王玉嬿老师提供。

1.2 试验设备

砍刀、枝剪,漏斗架、漏斗 (外口径 90～120mm)100个,试管架,口径 15～20cm塑料盘 30个,口径 10cm、高 6～10cm塑料杯 100个 (装样用),15 mm ×100 mm指形管 200个,25mm ×200mm大试管 30个,吸管 50个,载 (盖)玻片各 2盒,镊子,双层纸巾,双镜头电子显微镜,水浴锅,酒精灯,酒精,指示剂 1号等。

2 检测、鉴定方法

2.1 常规检测法

即贝尔曼漏斗法,线虫具有趋水性,游离于水中,由于重力作用沉淀下来。

2.1.1 取样 松材线虫的种群数量在罹病木中处于动态变化之中[6-7]。取样工作有一定的难度,要定期进行林间调查,发现疑是松材线虫病木,及时在发病初期,在树干的上 (尽量靠近第一枝分叉处)、中、下 (高出土层 20cm)分别取样。样本取下后单独包装,以免互相感染。记录样本编号、取样时间、地点、树种、树高、胸径、树龄、取样部位及有无松墨天牛和其它病虫危害,对样本进行及时的检测。未能及时检测的,取样时应相对大一点,以防样本失水而导致线虫死亡,影响检测鉴定结果。

2.1.2 样品制作 为了检测鉴定结果更加准确,尽量将样本剪切碎,以便装满漏斗,提高线虫量。根据漏斗的大小,样品重 10～100g。制作每份样品之间要将木块、碎屑清理干净。对于较干燥的样本,如包装板等,应增加样品的量。

2.1.3 分离线虫 先将清水慢慢注入漏斗中,并检查是否漏水,挤掉漏斗颈中的气泡。用适当大小的两层纸巾铺于漏斗中,将劈好的样品放在上面,轻轻将纸巾四周折到样品上,再注入水漫过纸包。夏季浸泡 4～12 h左右,冬季浸泡 12～24 h左右 (温度较低时,用 35～40℃的温水分离;或提高室内温度)。当线虫从样品中逸出并沉于橡皮管底部,慢慢打开弹簧止水夹,沉于底部的线虫顺水流入指形管,收集线虫液 2～8ml。线虫量较多时,用肉眼能看到,即可显微镜镜检;线虫较少的,离心 (3000r/min)2～3 min或沉淀 2～4h(放置时间长短视线虫量而定),吸去上层清液,再镜检。

2.1.4 线虫鉴定及分类 植物线虫的分类主要是根据其外部形态和内部结构的特征。本研究线虫鉴定的方法参照杨宝君等编著的《松材线虫病》[1]。

2.2 快速检测法

2.2.1 试验依据 木材中含有微量的碱金属和碱土金属,它们与木材中的有机酸形成相应的盐类[8],因此木材的水浸提液具有一定的缓冲性能,木材在一定程度上具有保持本身 pH值不改变的性能。相亚明在对国产 25种木材水浸提液的 pH值和缓冲容量的研究中,测得 8种针叶树材 pH值在 4.34～5.14范围内[7]。松材线虫病材的 pH值降低,可选适当的指示剂通过显色反应加以区分松材线虫病材与健材;通过采用被检木钻木屑的有机溶剂提取液进行颜色反应来区分松材线虫病、健木,利用指示剂 l号进行快速检验检疫,对马尾松的准确率为89%[9-10]。

2.2.2 样品的制备 靠近树皮的木质部连同树皮一起去掉,在靠近枯死木样本中间的、相对干净的部分取样。为节约成本,减少酒精的用量,尽量将样本剪切碎。本试验将样本制成长、宽、高均≤5mm的小粒,每份样品 5g,分别标记装入 25mm×200mm大试管中,选取棉塞将管口塞紧备用,以防在煮沸过程中酒精挥发掉,影响检测结果。

往各大试管中倒入 70%～80%的乙醇 ,约为样品高度的 1.5～2倍 ,并将管口塞紧。尽快将试管置于 80℃～90℃的水浴锅中,10min后取出置于冰水中冷却后备用 (样品超出 20个可适当延长 1～2min)。本试验所用的水浴锅为江苏金坛市江南仪器厂制造的 HH-2型双孔恒温水浴锅,一次可放 30个试管。

2.2.3 松材线虫病、健木的颜色反应 取若干个 15mm×100mm的指形管,并对应编号。将大试管中冷却的上清液谨慎倒入相应的指形管中 2～3 mL(或用吸管吸取,1个吸管对应 1个样品)备用。在每个指形管中滴入 1滴事先准备好的指示剂,摇匀,观察记录指形管中液体颜色的变化。

3 结果与分析

3.1 枯死木中线虫的种类

松材线虫可引起松树的毁灭性灾害[1];拟松材线虫对松苗和衰弱树有一定的致病性[11-12];松树中的其它线虫有无致病性,目前尚未见报道。所以,本研究以松材线虫和拟松材线虫为主。根据 2008～2010年对松枯死木中 (不含树皮)的线虫的检测鉴定结果,初步将其分为 4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫 (有待鉴定)。对每个样本中的线虫种类进行统计 (图 1),出现 14种类型。⑴只有松材线虫;⑵松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑶松材线虫和伞滑刃属其它线虫混生;⑷松材线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑸松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑹松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑺只有拟松材线虫;⑻拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫混生;⑼拟松材线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑽拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫混生;⑾伞滑刃属其它线虫;⑿伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫混生;⒀非伞滑刃属线虫;⒁无线虫。2008～2009年,以非伞滑刃属线虫的检出率较高,为 31.08%和 22.765;2010年,以伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫混生的类型检出率较高,为 39.68%。三年来,纯松材线虫检出率偏低,为 4.59%～5.95%。表明松树在遭到松材线虫侵染后期,由于其它线虫的大量繁殖,占据种群优势。松材线虫和拟松材线虫共存的现象比较少见,即⑵和⑹两种类型,三年来其最高检出率仅为 0.27%。2008～2010年,松材线虫⑴～⑹类型的检出率分别为 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趋势。

图 1 2008～2010年松枯死木中线虫类型分布

除去松材线虫样本,三年来,拟松材线虫⑺～⑽的检出率为 13.77%、16.05%、0.8%。据汤勤[11]等报道,用拟松材线虫接种重庆南山马尾松 ,对健康树无致病性,而对衰弱树的平均致死率为 5.88%。张治宇等[12]的研究表明:黑松苗在感染拟松材线虫后,用自然界水分胁迫和 PEG胁迫处理,能明显加快黑松苗死亡速度,且大大提高死亡率。关于我省拟松材线虫的致病性,有待进一步的研究。

伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫⑾～⒀类型的检出率分别为 50.93%、47.01%和52.37%,目前,有关的研究少见报道。无线虫检出率分别为 5.94%、8.68%和 22.62%,呈逐年增加。

3.2 2008年松枯死木中线虫分布

由于枯死木中的线虫种类不止 1种,在统计的时候会出现重复计算的情况,有几种线虫混生,就会得出几个样本的计算,但松材线虫的样本不存在这种情况。从研究结果看 (图 2),不同时间枯死木中的线虫种类和检出率是不相同的,但全年基本上能检测出松材线虫。2008年松材线虫最高检出率为 100%,平均为 34.59%。1月份,松材线虫检出率较高,然后逐月下降,到 6、7月最低;8、9月份又升高。与松材线虫相反,拟松材线虫的检出率是 6、7月份最高,为 75%～100%,年初和年末均较低,全年平均检出率为 12.65%。松材线虫检出率和拟松材线虫检出率的这种关系,可为今后松材线虫、拟松材线虫致病性的研究提供借鉴。

图 2 2008年松枯死木中线虫分布

3.3 2009年松枯死木中线虫分布

2009 年 5、10月松材线虫检出率 (图 3)较高 ,分别为 85%、66.07%,1、7、11、12月相差不大,处于 32.44%～37.68%之间。2月份由于样本数较少,5份样本均未检测出松材线虫,结果不足于说明问题。其它月份检出率相对较低,但全年基本上都有松材线虫枯死树出现,平均松材线虫检出率为 28.21%。拟松材线虫检出率是 9月份较高,为 25.06%,此时,松材线虫检出率较低,为 4.93%。

图 3 2009年松枯死木中线虫分布

3.4 2010年松枯死木中线虫分布

由于时间关系,2010年的枯死木检测结果统计到 8月份止。从图 4可见,松材线虫检出率 1月份为 50%,2月份 (样本较少)最低,然后逐月上升,到 7月份最高,为 73.33%,8月份下降为 40%。基本上每个月都有松材线虫病枯死木出现,平均松材线虫检出率为 24.19%。拟松材线虫的检出率较低,为 0.53%～2.43%。

图 4 2010年松枯死木中线虫分布

3.5 当年枯死木快速检测结果与常规检测结果对比

2010 年 7月 19日,对当年 3～6月常规检测的枯死木样本进行了快速检测,结果见表 1。

从表中可见,8、9、10、14、15号样本常规检测未检测到松材线虫,但快速检测显色反应依然为松材线虫病木。因当时仅取了枯死木的一处圆盘,松材线虫在树体中处于动态变化之中,树体的其它部位是否有松材线虫无法知道。对已检测为松材线虫的样本,快速检测的准确率达100%。

表 1 当年松枯死木快速检测结果与常规检测结果对比表

3.6 样本放置 1年后快速检测结果与常规检测结果的对比

2010 年 7月 11日对 2009年 3月 30日的剩余样本进行了常规与快速检测,结果见表 2。

表 2 松材线虫病枯死木放置 1年后快速检测与常规检测对比表

2009年 3月 30日常规检测的结果为:2号木的上、中部位和 5号木的下部无松材线虫,而2号木的下部、5号木的上、中部和其它枯死木均有松材线虫;3号木和 4号木的中、下部位,仅有幼虫,通过 1个星期的线虫培养后,确定为松材线虫样本。检测后,将样本直接放在室内,样本较干,无霉变现象,随着样本含水量的减少,线虫越来越少。1年后,至 2010年 7月 11日,对此批样本再次进行常规检测,结果均无松材线虫和其它线虫。但快速检测结果显示,1～5号木依然为松材线虫病木。6号木常规检测鉴定无松材线虫,但快速检测结果,其上部显示的是松材线虫病木。由此可见,利用快速检测法,可避免因取样时间、取样部位和松材线虫量不同所造成的影响,对 6株、18份样本的准确率可达 94.44%。对 5株、15个松材线虫病木样本的准确率达 100%。

4 小结

4.1 2008～2010年,福建省松枯死木松材线虫病检出率分别为 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趋势。松材线虫检出率与季节的关系有差异,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样和松材线虫病的检测鉴定增加了难度。及时进行林间松枯死木的调查、采样和室内松材线虫病的检测鉴定,在发病初期就发现,以便采取相应的防治措施。

4.2 对我省松枯死木中线虫的检测鉴定:初步将其分为 4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。它们在枯死木中的共存关系有 14种类型,其中松材线虫和拟松材线虫混生的情况比较少见,最高仅占 0.27%;2008～2010年,拟松材线虫 (⑵、⑹～⑽类型)占 14.04%、16.03%和 0.8%。拟松材线虫对衰弱的马尾松有一定的致病性;在干旱胁迫下,拟松材线虫能明显加快黑松苗死亡速度[12-13]。近几年来,我省一些松树常出现与松材线虫病相似的症状,但连续几年的取样、分离、鉴定结果是拟松材线虫。该拟松材线虫是否具有致病性,以及致病性如何,均有待进一步的研究。

4.3 松材线虫在树体中处于动态变化之中,松枯死木取样的时间、多少、部位等对检测结果都有一定的影响。2008年,松材线虫病检出率最高出现在 1、8、9月;2009年出现在 5、10月;2010年出现在 7月,松材线虫病检出率与季节尚没有一定的相关性。为了进一步提高松材线虫病检测鉴定的准确性,应在疑是树的不同部位分别取样,并增加取样的次数、数量。

4.4 王玉嬿等研究表明:利用指示剂 1号进行快速检疫检验,马尾松的准确率为 89%。本研究认为,利用指示剂 1号,对 26份松材线虫病枯死木样本的快速检测准确率达 100%。利用指示剂 1号进行快速检测,避免了因取样时间、取样位置等所造成的影响,实际工作中还是以常规检测鉴定为主。本文数据是以研究马尾松为基础,对湿地松和黑松等的显色反应如何,有待研究。

致谢:参加部分研究工作的还有黄金水教授级高工、何学友教授级高工、柯玉铸教授级高工、汤陈生工程师、蔡守平工程师、曾丽琼等同志,在此一并致谢!

[1]杨宝君,潘宏阳,汤 坚,等.编著.松材线虫病 [M].北京:中国林业出版社,2003.1-9.

[2]白兴月,程瑚瑞.松材线虫萎蔫病在中国南方林区流行的可能性[J].南京农业大学学报,1993,16(4):59-62.

[3]魏初奖.松材线虫病在福建省的潜在危险性分析及检疫对策[J].福建林业科技,1997,24(1):57-57.

[4]林庆源.福建省松材线虫病预防措施及可持续控制对策[J].福建林业科技,1998,25(2):55-58.

[5]黄金水,何学友.我国松材线虫病研究现状及福建省防范对策的探讨[J].福建林业科技,2001,28(4):12-17.

[6]宋玉双,臧秀强,刘阳,等.松材线虫在罹病木中种群动态的初步研究 [J].森林病虫通讯,1993,(2):9-11.

[7]杨希,黄金水,何学友,等.福建省马尾松枯死木中线虫检测结果分析[J].福建林业科技,2006,33(1):24-27.

[8]相亚明.国产 25种木材水浸提液的 pH值和缓冲容量[J],木材工业.1987,1(1):16-20.

[9]尤纪雪 ,宋桢,何文龙.区分松材线虫病材与健康材的研究 [J],林业科学,1994,30(2):145-150.

[10]王玉嬿,李海燕,舒朝然,等.几种松树松材线虫病木和 pH值差异的研究 [J],植物病理学报,2001,31(4):342-348.

[11]王玉嬿,舒朝然,李海燕,等.松材线虫病木快速检疫技术的研究[J],林业科学,2000,36(5):59-62.

[12]汤勤,昌世翠.拟松材线虫对马尾松致病性的研究初报 [J],西南农业大学学报,l989,11(3):264-265.

[13]张治宇,林茂松,余本渊.拟松树线虫对黑松苗的致病性[J],南京农业大学学报,2004,27(1):46-50

DETEM INATI ON M ETHOD AND RESULT ANALYSIS FORW ITHERED PINE WOOD IN FUJIAN

Yang Xi
(1.Fujian Academ y of Forestry Sciences,Fuzhou Fujian350012,China;2.Key Laboratory of Tim ber Forest B reeding and Cultivation forM ountainous A reas in Southern China,State Forestry Adm inistration,Fuzhou Fujian350012,China)

The nor mal deter mination method(Baermann funnelmethod)was applied to study the nematode species,interaction and result in withered pine wood.The nematode was preliminary classified to four categories:B ursaphelenchus xylophilus,Bursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-B ursaphelenchus.The interaction in the withered pine wood appeared to be 14 styles:⑴B ursaphelenchus xylophilus;⑵Bursaphelenchus xylophilus,B ursaphelenchusm rcronatusand non-B ursaphelenchus;⑶Bursaphelenchus xylophilusand others ofB ursaphelenchus;⑷B ursaphelenchus xylophilusand non-B ursaphelenchus;⑸B ursaphelenchus xylophilus,others ofB ursaphelenchusand non-B ursaphelenchus;⑹Bursaphelenchus xylophilus,Bursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⑺B ursaphelenchus m rcronatus;⑻B ursaphelenchus m rcronatusand others ofBursaphelenchus;⑼Bursaphelenchus m rcronatusand non-Bursaphelenchus;⑽B ursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⑾others ofB ursaphelenchus;⑿others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⒀non-Bursaphelenchus⒁no nematode.From 2008 to 2010,34.59%,28.21%and 24.19%of the tested wood were determinated to have nematode,showing that decreased each year;14.04%、16.03%and 0.8%of the tested wood were determinated to haveBursaphelenchus m rcronatus.Every year there was not significant difference be tween the the determination rate of nematode and the seasons,but all around the year the nematode was deter minated,thus the difficulty was increased for sampling the withered wood.The indicatorNo.1 was used to be fast determination,the result showed:its accuracywas100%to the nematodewood.As the time passed,the nematode disappeared gradually from the withered wood,which affected the nor mal deter mination and fast deter mination,thus the best time for deter mination was in initialwithering stages.

withered pine wood;deter mination method;nematode;fast deter mination;Fujian

S763.3

A

1001-4276-(2010)01-0038-09

2010-11-17

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD08A19126);福建省科技重大专项子专题(2006NZ0001-2-2);福建省林业厅项目 (闽林科[2007]函 04号)。

杨希(1963-),女,大学本科,高级工程师,研究方向:林木有害生物防控技术。