枯草芽孢杆菌A干粉菌剂的制备及其对桃果实病害的防治

李小俊,韩小艳,边艳青

(1.河北北方学院医学检验学院,河北张家口075000;2.河北师范大学生命科学学院,河北石家庄050016)

植物病害每年给农业生产带来巨大的损失,目前防治方法主要是采用化学农药,但化学杀菌剂的毒性大,污染环境,易产生抗药性.而生物杀菌剂由于其具有安全、环保等优点,越来越受到大家的关注.在众多的生物杀菌剂中,枯草芽孢杆菌类杀菌制剂是最具开发潜力的生物杀菌剂,因为它产生抗逆能力较强的芽孢,有利于生物杀菌剂的生产、剂型的加工及在所处环境中存活、定植与繁殖.国外已有不少枯草芽孢杆菌生防菌株商品化生产并投入使用,如 GBO3、MBI600、QST713和 FZB24,广泛用于蔬菜、瓜果及粮食作物的病害防治[1,2].中国在应用枯草芽孢杆菌防治植物病害方面也取得了很大的成绩,如菜丰宁B1[3],菜丰宁B2,麦丰宁B3[4],纹曲宁[5]等.此外还有很多有关枯草芽胞杆菌生物杀菌剂的研究处于实验阶段,未开发投入生产.

利用从玉米小斑叶片上分离到的一株具广谱抗真菌活性的细菌菌株为材料,经鉴定为枯草芽胞杆菌,命名为菌株A,对该菌的培养条件与发酵工艺的优化已经进行了研究[6],本试验主要进行干粉菌剂的制备及其对桃果实病害的防病效果的研究.

1 材料和方法

1.1 试验菌种

枯草芽孢杆菌A(Bacillus subtilis)：本实验室分离、鉴定和保存.

桃灰霉 (Humicola traaen)：本实验室保存.

1.2 试验方法

1.2.1 干粉菌剂的制备

将发酵液离心得到的湿菌体与等重量的CaCO3混匀,真空干燥箱中50℃烘干30 min至粉末状.将制得的干粉菌剂置于4℃、25℃、37℃保存,于保存0 d、5 d、10 d、15 d、30 d、60 d、90 d、180 d测定每克干粉菌剂中的活芽孢数,计算芽孢存活率.

1.2.2 菌株A对桃果实灰霉病的防治

菌株A菌悬液的制备：称取0.1 g菌株A干粉菌剂溶于100 mL水中,搅拌均匀得菌株A的菌悬液(约1.5×108cf u/mL),此菌悬液再稀释10倍 (1.5×107cf u/mL)、100倍 (1.5×106cf u/mL).三个浓度的菌悬液备用.

病菌孢子悬液的制备：将长满桃灰霉的 PDA平板中加入含0.01%Tween-80的无菌水将孢子洗下,经四层纱布过滤得孢子悬液,血球计数板计数,稀释浓度为1×104cf u/mL备用.

刺伤接种：选择无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子,先用2%的NaClO消毒,然后用自来水冲洗干净,晾干后在每个桃子上用灭菌的接种针刺一个为5 mm×3 mm,深度为3 mm的孔,孔中加入不同菌浓度的菌株A菌悬液20μL,2 h后,每孔中再加入桃灰霉孢子20μL.以刺伤后先接种无菌水,2 h后再接种桃灰霉孢子为对照.每处理九个果,各三个重复.每九个果放入一个塑料筐中,25℃储藏.从储藏第一天起,每天统计对照组和处理组的发病率计算防效.

1.2.3 菌株A对小批量桃贮藏保鲜实验

菌株A菌悬液的制备：同1.2.2.

喷洒接种：选择无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子,喷洒菌株A的菌悬液 (1.5×108cf u/mL),晾干后,单果用纸包裹放入纸箱中25℃储藏.每处理九个果实,三个重复.以不做任何处理为对照.随时观察发病情况,待有一部分果实发病时,统计发病情况,计算发病指数.

菌株A在果实表面定植测定：随机挑选处理过的水果,取表面2 cm×2 cm大小的果皮20片,放入无菌的生理盐水中,振荡30 min,将振荡后的生理盐水80℃水浴20 min,然后采用平板菌落计数法计算每平方厘米果皮上的活芽孢数.

2 结 果

2.1 干粉菌剂最适保存条件及保存期

新制备的粉剂芽孢含量可达2×1011cf u/g.从图1可以看出各个温度条件下,干粉菌剂中芽孢的存活率随着保存时间延长变化趋势一致,粉剂可常温保存,常温条件下至少可存放6个月甚至更长的时间,这还有待于进一步的试验.即干粉菌剂在各温度条件下,在保存10 d时干粉中芽孢存活率下降较明显,以后随着保存时间的延长,芽孢存活率基本维持在同一水平,即60%左右,每克干粉菌剂含芽孢保持在1011个以上.

图1 不同温度下干粉菌剂中芽孢的存活率

2.2 菌株A对桃采摘后灰霉病的防治

2.2.1 不同浓度菌株A菌悬液的防病效果

实验中选用 1.5×108cf u/mL,1.5×107cf u/mL,1.5×106cf u/mL三个浓度进行实验.实验统计发现1.5×107cf u/mL,1.5×106cf u/mL的菌株A菌悬液对桃子灰霉病的防治效果较差,接种病菌3 d后的防效仅分别为27.77%和37.03%,而浓度为1.5×108cf u/mL的菌悬液其3 d后的防效达90%以上,6 d后防效可达40.74%.由以上结果可见低浓度条件下菌株A防病效果不佳,故确定本实验的最佳作用浓度为108cf u/mL.

2.2.2 高浓度菌株A菌悬液的防病效果

提前在刺伤的孔中接种20μL菌浓度为1.5×108cf u/mL的生防细菌菌株A的菌悬液,防治桃灰霉病,结果如表1、图2和图3.

表1 高浓度菌株A菌悬液_(1.5×108 cf u/mL)对桃灰霉病的防效

图2 接种病菌4d后菌株A的防病效果

从表1能看出在较高的菌浓度条件下菌株A能显著降低灰霉病发病率,病菌接种4 d后防效达90%以上,6 d后的防效达到40%.从图2中也能看出接种病菌4 d后菌株A仍能显著抑制病菌在刺伤处的蔓延生长;而未接种菌株A只接种病菌桃灰霉的对照,所有桃子在刺伤接种的部位已经长出一个较大的病斑.

图3 接种病菌6 d后生防菌的防病效果

图3是接种病菌6 d后菌株A的防病效果,能明显看出未接种菌株A的对照桃子在刺伤接种的部位病斑直径增大,而处理组中仍没有灰霉病斑长出.由此可见高浓度 (108cf u/mL)菌株A的菌悬液能明显抑制桃灰霉,并且延长桃子的保鲜时间.

2.3 菌株A对小批量桃贮藏保鲜实验结果

在储藏7 d后,观察到部分桃开始发病,第8 d统计发病情况,并测定果实表面定植的活芽孢数.结果见表2.

表2 菌株A菌悬液对桃储藏保鲜效果

由表2可以看出菌株A菌悬液对桃储藏有明显的保鲜、防病效果,保存8 d的防效为55.49%.对照果实表面芽孢数仅为 (8.06±0.35)×103cf u/cm2,而菌株A菌悬液处理的果实其表面定植的芽孢数数量级达到106cf u/cm2,为对照的200倍左右.这说明菌株A可以在果实表面定植.

3 讨 论

在获得大量发酵液的基础上,本实验对生防菌菌株A的剂型进行了研究.现报道的已开发的枯草芽孢杆菌的制剂多为粉剂、可湿性粉剂和水剂等,制备的菌剂芽胞含量多数在108～1011cf u/g之间.如南京农业大学开发的菜丰宁B1、B2,麦丰宁B3,研制成的主要剂型为粉剂,产品含菌量5×108cf u/g以上[7].河北省农林科学院植物保护研究所研制的用于防棉花枯萎病的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂其芽孢含量为1010cf u/g[8].用于防治水稻纹枯病的“纹曲宁”是2.5%井冈霉素与108cf u/g活枯草芽孢杆菌制成的水剂[9].武汉科诺生物农药有限公司生产的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂活芽孢数为1011cf u/g[10].本实验选择将枯草芽孢杆菌菌株A制备成干粉菌剂,而且新制得的粉剂活芽孢含量高达2×1011cf u/g,保存180 d芽孢含量仍能保持在1011cf u/g以上.说明此方法制备粉剂效果好,芽孢含量与相关研究相比较高,而且既易于保存运输,这为菌株进一步的开发应用提供了有利的理论基础.

本实验进行了菌株A干粉菌剂对桃子防病保鲜效果的研究,发现作用浓度较高时 (108cf u/mL)其防病效果明显.测定喷洒菌株A后储藏桃子表面的活芽孢数,发现其表面每平方厘米的芽孢数明显高于未经菌株A处理的对照,说明菌株A可在桃子果实表面定植,这可能是其防病的一种机制.关于生防细菌定植的研究有很多相关的报道,如河北农业大学杜立新等研究发现枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209菌株可在番茄叶面和土壤中定植[11].福建农林大学蔡学清和何红等人研究发现枯草芽孢杆菌BS-2和BS-1可在多种蔬菜体内定植[12],而且研究发现两菌株还可在辣椒体内繁殖和传导[13].由于本研究主要侧重于应用方面,所以没有从更深层次对菌株A的定植情况进行研究.此外菌株A对其它果蔬病害和作物病害的防病促生效果有待进一步的研究,从而为扩大其应用范围提供理论基础.

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