西瓜多倍体鉴定方法的研究

施先锋，彭金光，李煜华，曾红霞，杜念华，汪李平

(1.湖北省武汉市农业科学研究所，湖北 武汉 430051;2.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070)

三倍体西瓜兼具多倍体优势和杂交优势，由于无种子，能使更多的养分转化为糖，具有品质更好、食用方便、耐贮运等诸多优良品质特点，而且也有较强的抗病性和抗逆性，因此倍受消费者欢迎。而三倍体西瓜种子是通过以四倍体为母本，二倍体为父本进行杂交获得的，因此诱导西瓜四倍体的研究显得尤为重要。而在四倍体育种中，通过秋水仙素诱导获得的植株往往出现不同倍性的嵌合体、甚至八倍体，因此，有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。虽然有关倍性鉴定已有较多报道［1-2］，但有关西瓜染色体倍性鉴定方法系统的研究甚少。本研究试图通过研究、比较各种倍性鉴定方法，建立一套简便、准确、高效的西瓜倍性鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试3个西瓜品种均来自华中农业大学西甜瓜实验室的二倍体及秋水仙素诱导获得的同源四倍体，编号为 TS、MY和0517。栽植于华中农业大学国家蔬菜改良中心华中分中心的试验大棚中，采用立体栽培方式，单蔓整枝，田间管理同一般大棚。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定法

根据植物多倍体形态特征［3］，结合田间生长情况，观察植株的叶片、花瓣大小及果皮厚度等特征进行初步鉴定。

1.2.2 流式细胞仪鉴定法

采用德国Partec公司的PA流式细胞仪(Ploidy Analyser-I，Partec)检测倍性。在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室进行。该倍性分析仪带PC和自动分析及倍性判别软件。试验方法参考张俊娥等［4］。

1.2.3 根尖染色体计数法

染色体制片方法采用去壁低渗法［5］，在Olympus BH-2型显微镜观察和照相记录。1.2.4 叶绿体计数法

待植株长至坐果期时，9:00时，田间取幼嫩叶片，撕取叶片下表皮，置于载玻片上，滴1滴蒸馏水，盖上盖玻片，在AH3-RFCA型Olympus万能荧光显微镜下观察气孔保卫细胞。在分辨率为2 040×1 536的条件下照相并计算叶绿体数。

1.3 数据处理

用SPSS15.0做配对样本t检验和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

四倍体植株伸蔓期比二倍体生长要缓慢些，但幼苗出现分枝后，快速生长。

由图1可见四倍体的叶片比二倍体的叶片大而且厚，颜色也较深;雄花花瓣大且厚，颜色更为鲜艳，花柄更长和粗;四倍体的果皮比二倍体的厚，种子少且厚。

2.2 DNA流式细胞仪倍性鉴定

试验结果显示，二倍体植株主峰荧光强度位于50 AU(图2中A)，而四倍体主峰荧光强度位于约100 AU(图2中B)，说明四倍体植株细胞DNA含量为二倍体的2倍。

2.3 染色体数目鉴定

染色体压片观察二倍体的根尖染色体数均为2n=2x=22(图3中 a)，四倍体的染色体数目则为2n=4x=44(图3中b)，是二倍体的2倍。

图1 二倍体与四倍体的形态学比较

图2 植株叶片中DNA含量分布曲线

图3 二倍体 (a)与四倍体 (b)的染色体

2.4 气孔保卫细胞中叶绿体计数法

由表1可见，相对二倍体的气孔保卫细胞叶绿体数而言，对应同源四倍体的叶绿体数均有所增加。配对样本 t检验结果表明，t=-13.22，t检验的双尾显著性概率0.006＜0.01，表明二倍体和四倍体间的叶绿体数差异达极显著水平。经单因素方差分析，二倍体不同品种间的F分布的显著性概率0.68＞0.05，四倍体的概率0.27＞0.05，说明同一倍性不同品种间叶绿体数差异不显著。

综上所述，不同倍性间差异极显著，而同一倍性不同品种间叶绿体数差异不显著。因此，气孔保卫细胞叶绿体数目可作为染色体倍性的鉴定依据之一。从图4可清晰区分不同倍性西瓜气孔保卫细胞叶绿体数的差异。

表1 二倍体和四倍体气孔保卫细胞中叶绿体数比较

图4 西瓜不同倍性气孔保卫细胞及其叶绿体数

3 小结与讨论

在诱导西瓜多倍体过程中，准确及时鉴定出四倍体不仅可缩短育种周期，还能提高四倍体育种工作效率。郭启高等［6］在离体培养过程中利用不定芽叶尖染色体计数，在组织培养早期100%检出倍性。利用流式细胞仪可快速检测出西瓜再生芽倍性［7］。谭素英［8］研究认为在西瓜上叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。二倍体和四倍体西瓜植株在形态上有比较明显的差别。Compton等［9］研究发现子房直径、雄花的花瓣和花粉囊直径、叶长与叶宽比是西瓜倍性水平很好的标志。本试验结果表明:染色体计数法作为直接的倍性鉴定方法，精确、可靠，但费时且需要熟练的细胞学操作技术;流式细胞仪可用于西瓜的早期倍性鉴定;保卫细胞叶绿体数目与西瓜倍性密切相关，是有效的间接方法;二倍体和四倍体植株在长势、花冠形态、果皮厚度及种子数量和厚度等方面有明显差异，也能初步确定西瓜倍性，但要在较晚时期鉴定，难以及时采取加倍等措施，使育种材料不能得到充分利用。

［1］ 刘文革，阎志红，饶小莉.不同倍性西瓜的叶表皮微形态特征比较 ［J］.果树学报，2005(1):31-34.

［2］ Compton M E，Barnett N ，Gray D J.Use of fluorescein diacetate(FDA)to determine ploidy of in vitro watermelon shoots ［J］.Plant Cell Tissue Org Cult，1999，58:199-203.

［3］ 王志敏，牛义，宋明，等.多倍体诱导在蔬菜育种上的应用［J］.生物学杂志，2004，21(6):35-38.

［4］ 张俊娥，刘继红，邓秀新.采用倍性分析仪鉴定柑橘愈伤组织的遗传变异 ［J］.遗传学报，2003，30(2):169-174.

［5］ 马双武，刘君璞，王吉明，等.西瓜种质资源描述规范和数据标准 ［M］.北京:中国农业出版社，2006.

［6］ 郭启高，宋明，杨天秀，等.西瓜试管苗中四倍体鉴定方法研究 ［J］.西南农业大学学报，2000，22(3):298-300.

［7］ Zhang X P，Rhodes B B，Whitesides J F.Shoot regeneration from immature cotyledons of watermelon ［J］. Cucurbit GenetCoop Rep，1994，17:102-105.

［8］ 谭素英.西瓜不同倍体叶保卫细胞中叶绿体数观察 ［J］.果树科学，1985，2(1):34-36.

［9］ Compton，M E，Gray D J ，Elmstrom G W.Identification of tetraploid regenerants from cotyledons of diploid watermelon cultured in vitro ［J］.Euphytica，1996，87:165-172.