正交设计法优化伊贝母酒炙工艺

刘雯霞， 陈韩英*， 谭 勇， 王 琪， 李 鹏， 唐代荣

(1.新疆特种植物药资源省部重点实验室，新疆石河子832002;2.石河子大学药学院，新疆石河子832002)

伊犁贝母(Fritillaria pallidi flora Schrenk)为百合科贝母属植物，其干燥鳞茎是中药伊贝母的主要来源，有清热润肺、化痰止咳功效［1］。伊贝母的主要成分为异甾体生物碱及苷类，尤以西贝素(imperialine)和西贝苷(imperialine-3β-D-glucoside)为其主要成分［2］。药理研究证明西贝素及其苷对大鼠离体气管和支气管有显著的松弛作用［3］及抗胆碱能活性［4］，是伊贝母的主要活性成分。

伊贝母传统用药多为生品，本实验基于酒炙能够增强伊贝母中生物碱的溶出度，采用正交优选和高效液相色谱相结合的方法，对能够影响伊贝母中生物碱溶出率的因素如酒的种类，酒的用量和加热温度进行优化，探讨不同炮制工艺对伊贝母中生物碱含量的影响，为伊贝母炮制工艺和临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 HPLC岛津LC-20AT高效液相色谱仪(岛津);CBM-20A型色谱工作站;SEDEX60 LT型蒸发光散射检测器(迪玛);万分之一天平(赛多利斯)。

1.2 样品与试剂 伊贝母药材购自新疆伊犁，经石河子大学药学院中药系副教授谭勇鉴定为伊犁贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)的干燥鳞茎;西贝素标准品(购自中国药品生物制品检定所);乙腈(色谱纯，江阴精细化工研究所)，蒸馏水(三蒸)，二乙胺(分析纯，南京化学工业公司);白酒(酒精度数50度，石河子白杨酒厂)，黄酒(酒精度数13度，绍兴糯米老酒)，米酒(酒精度数10度，化正利源酒厂)。

2 方法与结果

2.1 酒炙伊贝母 取净制的伊贝母100 g，用规定量不同种类的酒拌匀，闷润至酒被药材吸尽，置于烘箱内，按照预定的温度和时间分别烘制，中途翻动1～2次，取出后放凉备用。

2.2 正交实验 称取粉碎并干燥的伊犁贝母粗粉，按表1设计的因素水平进行正交实验，见表1。

表1 因素水平表

2.3 西贝素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(5 μL，4.6 mm ×250 mm);流动相:乙腈-水-二乙胺(80 ∶20 ∶0.05);流速:1.00 mL/min。检测器参数:漂移管温度:75℃;氮气流速:2.00 L/min;气压:200 kPa。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取在60℃真空干燥至恒重的西贝素对照品10.02 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得对照品贮备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 伊贝母各炮制品分别粉碎过40目筛，干燥至恒重，分别精密称取各粗粉2.0 g，加氨水0.2 mL浸润1 h，加混合溶剂氯仿-甲醇(4 ∶1)20.0 mL，称重，混匀，超声提取25 min，放置过夜，称重，加混合溶剂补足重量，滤过，弃去初滤液，收集续滤液10.0 mL，续滤液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗涤，定容于2 mL量瓶中，以峰面积计算西贝素含量。其色谱图见图1。

图1 西贝素对照品(A)，伊犁贝母样品(B)HPLC色谱图

2.3.4 标准曲线的制备 精密吸取西贝素对照品贮备液(1.002 mg/mL)1、0.75、0.5、0.275、0.25 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液20 μL，按上述色谱条件测定。以峰面积(y)为纵坐标，进样量(x)为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程 y=1.681 6x-1.830 8，r=0.999 6，线性范围 0.031 63 ～1.012 μg/mL，结果表明在此范围内存在良好的线性关系。

2.3.5 样品的含量测定及结果分析 按照2.3.3项供试品溶液的制备方法和2.3.1项下的测定条件，对各酒炙样品进行含量测定，结果及分析见图1及表2、表3。

表2 伊贝母中西贝素含量正交试验结果

表3 方差分析表

分析结果表明，三因素中B因素即酒的用量对实验结果影响最大，为伊贝母酒炙的主要影响因素，加热温度C为次要因素，各因素对西贝素含量的影响结果依次为B＞C＞A。进一步的方差分析说明(结果见表3)，只有因素B对西贝素的含量有显著性的影响，综合分析，在伊贝母酒炙工艺中，最佳工艺条件为A1B3C3，即40 g/100 g净药的白酒110～120℃烘干。

2.4 精密度实验 精密吸取同一浓度的西贝素对照品溶液，按照上述色谱条件，连续测定6次，记录峰面积，结果西贝素峰面积的RSD=1.2%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验 取2.6项重复性试验下同一份供试品溶液，按照上述色谱条件，12 h内每2小时测定一次西贝素的峰面积。结果表明供试品溶液在12 h内稳定，其峰面积的RSD=1.8%(n=6)。

2.6 重复性实验 精密称取伊犁贝母炮制品1号粉末1.0 g，平行6份，按2.3.3项供试品制备方法制备供试品溶液，以外标法计算西贝素的含量(%)，计算测定结果的RSD为2.8%(n=6)。

2.7 加样回收率实验 取已知含量的伊犁贝母药材粉末1.0 g，平行6份，按照高中低分别精密加入西贝素对照品，按2.3.3项供试品制备方法制备供试品溶液，计算加样回收率。结果西贝素平均回收率为100.95%。RSD为1.18%。结果见表4。

表4 加样回收率试验结果(n=6)

2.8 验证实验 为确证该工艺的稳定性，在上述正交实验的基础上，按筛选的最佳工艺条件，进行了重复验证实验，并与生品进行含量对比。称取净制的生品伊贝母100 g，按2.3项下“西贝素含量测定法”各进行3次实验，生品伊贝母西贝素平均含量为0.066%(RSD=1.90%)。另取生品伊贝母100 g，按照以上最优炮制工艺参数各进行3次实验，炮制伊贝母平均含量为0.092%(RSD=1.80%)，表明优选工艺切实可行。

2.9 水煎液中西贝素含量测定 中药饮片多为水煎使用，该实验对生品及炮制品中西贝素含量进行比较。取2.8项下样品，分别精密称取各粗粉2.0 g，加水20.0 mL，称重，混匀，煎煮 60 min，放置过夜，称重，加水补足重量，滤过，弃去初滤液，收集续滤液10.0 mL，续滤液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗涤，定容于2 mL量瓶中，以峰面积计算西贝素含量。结果见表5。

3 讨论

本实验所用的流动相为乙腈-水-二乙胺，经查阅相关资料，有3种比例可用于该实验，分别为55∶45 ∶0.05、70 ∶30 ∶0.05、80 ∶20 ∶0.05，本实验结果表明，80∶20∶0.05为最佳流动相比例。

表5 生品与炮制品伊贝母水煎液西贝素含量比较

由实验数据分析可知，酒的用量对实验结果有显著性影响，得到最佳工艺条件为A1B3C3，即40 g/100 g净药的白酒110～120℃烘干。因此在对伊贝母进行酒炙时必须注意酒的用量，该实验认为110～120℃为最佳温度条件，可能是温度升高后有利于伊贝母中生物碱的溶出。验证试验对生品伊贝母与最佳工艺炮制品西贝素含量比较，生品伊贝母明显低于炮制品含量。并分别对其水煎液进行含量测定，同样生品水煎液中西贝素含量明显低于炮制品。可见经酒制能够明显提高伊贝母中西贝素的溶出率。

实验优选最佳工艺40 g/100 g净药的白酒110～120℃烘干与传统工艺低度黄酒工艺不一致，笔者认为伊贝母中西贝素属西藜芦碱类，为极性较小的脂溶性生物碱，降低极性能够增加西贝素溶出，白酒度数较黄酒高，就达到了西贝素溶出率提高的目的，同时酒的用量也较传统10～30 g用量高，同样反映出了极性对西贝素溶出率的影响。

［1］中国药典［S］.一部.2005:95-96.

［2］伊江兰，麦迪尼亚提.伊贝母总生物碱的研究概述［J］.新疆中医药，2002，20(4):77-79.

［3］Chan SW，Kwan Yw，Lin G，et al.The effects of Fritillaria alkaloids on isolated trachea and bronchi［J］.Pharm Sci，1998，1:369.

［4］Atta-ttr-Rahman，Choudhary MI，Farooq A，et al.Structure activity relationships of imperialine derivatives and their antichotinergic activity［J］.Planta Med，1998，64(2):172-174.