响应面分析法优化胡芦巴渣中黄色素提取工艺研究

李婉婷， 李稳宏*， 唐 璇， 赵 鹏， 李学坤， 杜海胜

(1.西北大学化工学院，陕西西安710069;2.西安石油大学化学化工学院，陕西西安710065)

胡芦巴为一年生豆科植物，具有营养、滋补的功效，一直以来被作为药食同源之品［1，2］。胡芦巴具有温肾，祛寒，止痛等功效，胡芦巴中的半乳甘露聚糖胶已被成功广泛地应用于医药化工、食品、石油开采等行业［3］。近年来人工合成色素虽深受食品工业欢迎，但由于其对人体有影响与危害，因此人们越来越重视天然色素的开发与应用［4，5］。脱胶后的胡芦巴渣颜色鲜黄，是一种提取天然黄色素的理想资源。本文重点对胡芦巴黄色素提取工艺进行了一定的探索，旨在为开发和利用该色素提供科学依据。

1 试验材料及仪器

材料及试剂:胡芦巴渣;硅胶G，薄层层析用;乙醇等有机溶剂均为分析纯。

试验仪器:双波长紫外检测器，2487型，美国Waters;721分光光度计，上海第三分析仪器厂;TG328A分析天平，湖南湘仪仪器厂;8302型电热恒温水浴，巩义市英峪予华仪器厂;RE－52AA旋转蒸发仪，上海嘉鹏科技公司。

2 分析方法与结果

2.1 胡芦巴渣中黄色素分析检测方法

用紫外－可见分光光度计对胡芦巴色素的水溶液在波长范围为200～700 nm内进行扫描，结果见图1。由图可知，该色素存在两个吸收峰分别为273 nm和336 nm，336 nm处于较为理想的分光光度计工作范围内，故选此波长处测定样品的吸光度。

图1 胡芦巴色素的紫外-可见光光谱图

2.2 样品溶液中胡芦巴黄色素的含量测定

2.2.1 胡芦巴黄色素对照品的制备

将提取液的浓缩物经反复柱层析纯化精制作为色素对照品。

2.2.2 标准曲线的绘制

精确称取精制得到的胡芦巴黄色素100 mg置于100 mL量瓶，加蒸馏水定容后摇匀，配制成1 mg/mL的水溶液。分别精密吸取0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 分别置 10 mL 量瓶，定容摇匀，在336 nm波长处测其吸光度。求得吸光度和浓度的回归方程为A=3.527 2C+0.014 9，R2=0.999 9。结果表明在0.05～0.4 mg/mL浓度范围内，胡芦巴黄色素提取液的吸光度与浓度线性关系良好。

2.2.3 胡芦巴色素浓度测定

将提取得到的胡芦巴黄色素溶液量取5 mL，定容至50 mL，在336 nm处测定Abs值，根据浓度与吸光度的线性关系，可得到胡芦巴黄色素浓度。

2.2.4 胡芦巴色素的色价

精确称取胡芦巴黄色素1.000 g，用90%乙醇定容至100 mL，配成1%的色素乙醇溶液，在336 nm下用1 cm比色皿，测定样品的吸光度，按下列公式计算求得色价:

式中 E—表示在1 cm比色皿，在相应λmax处溶液浓度为1%时的色价;A—在λmax处的吸光度值;V—溶液的体积(mL);m—样品重量，g。

2.2.5 提取溶剂的选择

称取脱脂胡芦巴渣5 g，在温度65℃、液料比8∶1 mL/g的条件下，分别用无水乙醇、氯仿等溶剂提取2 h，将各提取液取5 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，实验结果见表1。

表1 不同提取溶剂的对比

由表1可知，胡芦巴黄色素难溶或不溶于非极性溶剂，易溶于无水乙醇，故后续试验均采用乙醇为提取溶剂。

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇浓度的影响

分别称取5 g脱脂胡芦巴渣原料5份，在温度65℃、液料比为8∶1 mL/g的条件下，提取2 h，将各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，考察乙醇浓度对提取效果的影响，实验结果见图2。由图可知，90%的乙醇溶液提取效果最为理想。

图2 乙醇浓度对提取过程的影响

2.3.2 提取时间的影响

分别称取5 g脱脂胡芦巴渣原料5份，以90%乙醇为提取溶剂，在液料比8∶1 mL/g、温度65℃的条件下提取不同时间，将各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，考察提取时间对提取效果的影响，试验结果见图3。

图3 提取时间对提取过程的影响

由图3可知，提取液的吸光度随提取时间的增加而增大，但当提取时间超过2 h时，其吸光度值变化趋于平缓。

2.3.3 料液比的影响

分别称取5 g脱脂胡芦巴渣原料5份，以90%乙醇为提取溶剂，分别以不同的液料比在65℃下提取2 h。将各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，实验结果见图4。

由图4可知，当液料比大于10∶1 mL/g时，提取液吸光度变化缓慢，所以液料比10∶1左右为宜。

图4 液料比对提取过程的影响

2.3.4 提取温度的影响

分别称取5 g脱脂胡芦巴渣原料5份，以90%乙醇为提取溶剂，在液料比10∶1 mL/g，提取2 h，将各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，考察提取温度的影响，试验结果见图5。

由图5可知温度70℃左右时提取效果最好，超过70℃时吸光度反而降低，可能是因为温度过高对色素会有一定的破坏所致。

2.3.5 提取次数的影响

分别称取5 g脱脂胡芦巴渣原料5份，以90%乙醇为溶剂，在液料比10∶1 mL/g，70℃下提取2 h，将各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下测定其Abs值，研究提取次数对提取的影响，试验结果见图6。

图6 提取次数对提取过程的影响

由图6可知:提取超过2次后其对提取液吸光度明显减小，从经济方面考虑提取3次即可。

2.4 响应面试验

根据 Box－Benhnken的中心组合实验设计原理［6］，综合单因素实验影响结果对比分析可知，提取温度、时间、液料比对胡芦巴色素提取效果影响较为显著，故以该三因素设计了三因素三水平的响应面分析方法进行优化试验，试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面分析因素水平表

经过RSM软件对所得数据回归分析，响应面中心组合试验结果见表3，方差分析见表4。

由表4可知，模型的显著性F值=50.03＞0.05，显著性水平P值＜0.000 1，表明该模型是显著的，即试验是可靠的。分析结果方程的一次项、二次项都是显著的，因此，说明各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。结果作用显著的是由此还可以看出交互项交互影响不显著，即表明温度、提取时间、料液比之间交互作用不显著。

表3 响应面中心组合试验结果及预测值

表4 方差分析

利用design expert软件对二次回归方程的响应面图分别见图7、图8和图9。

图7 液料比与温度交互作用对提取的影响

由上图可知，提取因素影响的大小依次为提取温度、提取时间和液料比，其中提取温度的影响最为显著，表现为曲面较为陡峭。

经软件对各因素回归拟合后，得到回归方程:Y=0.49+0.048x1+0.028x2+0.011x3－0.005 225x1x2－0.001x1x3+

图8 提取时间与温度交互作用对提取的影响

图9 液料比与提取时间交互作用对提取的影响

根据所得到的模型，可预测在稳定状态下的最大响应值为Y=0.508，对响应面结果利用软件进行优化分析，以黄色素Abs值为评价指标，得到相应的提取工艺优化条件为:温度73.3℃，试验时间2.3 h，液料比10.4∶1 mL/g。

为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行胡芦巴渣黄色素的提取试验，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为提取温度70℃，试验时间2.3 h，液料比10∶1 mL/g，提取3次;共进行了3次平行试验，结果见表5。由表中数据可知，在优化条件下提取液中黄色素的平均吸光度值与理论预测值吻合程度良好。

表5 重复验证试验结果

3 结论

3.1 得到了一条从胡芦巴渣中提取黄色素的工艺路线。在溶剂筛选以及单因素试验基础上，通过响应面试验得到了该工艺路线优化的工艺操作参数:乙醇浓度90%，提取温度70℃，提取时间2.3 h，液料比10∶1 mL/g，提取次数3次，色素色价为32.43。

3.2 胡芦巴黄色素溶液在273 nm和336 nm处有较为强烈的吸收峰，多数的黄酮类化合物由两个主要吸收带组成，带I在300～400区间，带II在240～285区间，因此可初步推断胡芦巴黄色素为黄酮类色素。

3.3 研究结果不但可提高废弃脱胶胡芦巴渣的资源化综合利用价值;同时可提供一条新的天然黄色素途径。

［1］蒋建新，朱莉伟，徐嘉生，等.从制胶后的胡芦巴种子中提取甾体皂甙元的研究［J］.天然产物研究与开发，2000，13(1):49－51.

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