PCR技术在产前诊断常见非整倍体疾病中的临床应用

董小欢 贺静 综述 朱宝生 审校

（昆明医学院附属昆华医院，云南省第一人民医院遗传诊断中心，云南 昆明 650032）

非整倍体疾病是一类因染色体数量异常引起的综合征，目前尚无有效的治疗方法。非整倍体疾病以三体型和单体型常见，95%以上的三体综合征在出生前流产［1］。活产儿中最常见的三体综合征包括21-三体综合征（Down Syndrome）、18-三体综合征（Edwards Syndrome）、13-三 体 综 合 征 （Patau Syndrome）、Klinefilter综合征，单体综合征以Turner综合征最为常见。常染色体单体综合征几乎不能存活到足月分娩。存活的非整倍体疾病患者表现出不同程度的智力低下、身材矮小、特殊面容、性发育不良以及其他各种组织器官的畸形等，生活难以自理，给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。这些疾病目前尚无有效的治疗方法，仅能通过产前筛查和（或）产前诊断后通过选择性人工流产措施避免此类患儿的出生。

染色体核型分析是诊断非整倍体疾病的金标准，它能提供准确、丰富的信息量［2］。然而该技术耗时长，对人员的操作技术要求高［3］。荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）技术虽无需进行细胞培养，但染色体特异性探针的成本较高，每批次能检测标本的规模较小，而且劳动力密集［2］。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术自20世纪80年代中期问世以来，凭借快速、简便、灵敏等优势而被广泛应用，随着分子生物学技术的发展，近年PCR技术在非整倍体疾病快速诊断应用中发展迅速，比较传统的细胞培养而言，PCR技术具有试剂成本相对较低、检测批量大和快速的优势。本文分别从定性、半定量、定量不同层次，探讨PCR及相关技术在常见非整倍体疾病的产前诊断中的应用。

1 定性PCR

1.1 STR-PCR技术 短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR）即微卫星位点，广泛存在于人类基因组，以2～6个碱基为单位串联重复排列。STR一般遵循孟德尔共显性遗传规律，具有杂合度高、多态信息量大的特点，因此可作为一种遗传标记，用于染色体病、单基因病等多种遗传病的产前诊断。其产生机制是复制滑脱或者DNA互补链碱基错配导致重复单位的插入［4］。1991年，Edwards等［5］建立了STR-PCR分型技术。该法选用染色体上的STR位点进行PCR扩增后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显带分型，根据条带的数目及浓度判断是否为三体综合征。

朱金玲等［6］选择21号染色体上的4个STR位点（D21S2055、D21S1244、D21S1435、D21S1809）用该法检出了所有由核型分析确诊的单纯型21-三体，并可判定额外染色体的亲代来源。王欢等［7］选择21号染色体关键区域内部及附近的6个STR位点 （D21S11、D21S1412、D21S1437、D21S1413、D21S1446、D21S1270），采用该技术快速产前诊断5例单纯型21-三体综合征。自2007年1月到2009年12月，本院常规选用5个STR位点（D21S11、D21S1437、D21S1411、D18S535、D18S1002），对1 968名孕妇进行了快速产前诊断，共诊断19例唐氏综合征、10例18-三体综合征，其结果与染色体核型分析基本一致。

STR-PCR技术具有简单、安全、成本低的优点［8］。PCR反应需选用具有高度多态性的STR位点，当胎儿在某位点上为纯合子时则无法提供诊断依据。本院诊断的1 968例标本中出现了1例特殊样本，在5个常规STR位点上均表现为纯合子，因此无法明确诊断。应用该方法，同时结合亲代的基因型可以判断子代额外染色体的来源，还可判断染色体不分离发生的时间［9］。当三体综合征的实验结果表现为浓度1：1：1的3条带时，提示减数分裂I期同源染色体不分离；表现为浓度1：2的2条带时，提示减数分裂II期姐妹染色单体不分离。

此外，本方法可以鉴别标本中是否存在母血污染，但对于易位型或嵌合型的染色体三体可能漏诊。该方法在实验结果的判断上易受主观因素的干扰从而影响其准确性，因此该方法终会被定量PCR所取代，以降低漏诊率和假阴性。

1.2 甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP） MSP法的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。基于这种碱基的改变，分别设计2对针对甲基化与非甲基化等位基因的引物，PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物就可以将甲基化与非甲基化等位基因区分开。

Sergio等［10］利用X染色体上FMR-1基因来进行X染色体的倍性分析，并设计了2对引物进行检测。用亚硫酸氢钠处理DNA样品后甲基化的X染色体上CpG岛的胞嘧啶并未发生改变，这样其中一对引物的PCR产物为142 bp的片段；另一对引物针对处理后未甲基化的Cp G岛合成84 bp的产物。在整个基因组中，Cp G岛通常位于基因的启动子区域，在正常情况下，Cp G岛是以非甲基化形式存在于基因的启动子内。但有两个例外，其中1个是在已失活的X染色体上的基因，如女性的1条X染色体。在这种情况下，其启动子区域的Cp G岛是甲基化的，而且这种甲基化是与该基因的转录抑制有关。应用该法，正常女性可见142 bp和84 bp的2个片段，而特纳综合征的女性仅见84 bp的片段，同时利用15号染色体上SNRPN基因的Cp G岛作为内对照。在研究中，作者对1例特纳综合征的胎儿进行了产前诊断，并对20例已确诊的特纳综合征患者及42例正常女性对照进行X染色体的倍性分析。研究结果显示该种诊断方法灵敏度高，准确率达100%，而且该方法简单易行、快速高效（整个实验可以在48小时以内完成）、准确、并无需使用昂贵的设备。该方法的建立为进行X染色体的倍性分析提供了一条简单易行的途径，但是该方法是利用X染色体的失活来进行检测的，所以只能用于进行X染色体的倍性分析。

1.3 多连接依赖性探针扩增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） MLPA是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定量分析的技术，基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过特异化连接，PCR扩增连接完好的探针，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，相关软件对收集的数据进行分析，得出产物峰的峰面积、峰高度，根据特定基因拷贝数的改变，即可确定染色体数目的异常。

Dan等［11］对517例自然流产胎儿进行染色体核型分析，发现其中7例表现为2条染色体三体，对这7例样本进行MLPA，准确的诊断了这7例样本的核型。范新萍等［12］采用该技术检测34份标本13、18、21、X和Y染色体拷贝数的变化，其结果除一份提示母血污染外，其余33份外周血、脐带血或羊水标本报告均与染色体核型分析结果一致，临床符合率97.1%。

MLPA是一种敏感性高、准确性高、快速经济的诊断方法，但不能应用于检测被污染的羊水标本，亦不能用于检测STR位点及染色体的平衡易位。

2 半定量PCR

2.1 引物原位标记（primed in situ labeling，PRINS） PRINS是由细胞遗传学、分子生物学以及免疫学技术相结合形成的一种新技术，该技术将FISH与PCR结合起来，其基本原理是应用寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合，然后用非同位素标记的脱氧核苷酸（d UTP）参与延伸反应，标记了的d UTP将以碱基配对的形式掺入新合成的DNA单链中，最后用相应的荧光抗体与标记物结合，在荧光显微镜下观察荧光信号。

Kirsten等［13］用该技术成功地对262例未培养的羊水标本进行检测，诊断其中的2例18三体，无假阳性及假阴性结果。刘杨等［14］采用该技术对10例典型三体型唐氏综合征患者进行基因诊断，结果均显示3个明显的标记信号。

与FISH相比，该方法更快速、简便（仅需1～2小时，前者常需过夜）、价格低廉（费用为FISH的1／10），可鉴别13与21号染色体（FISH由于采用着丝粒探针，13与21号染色体存在高度同源性故常发生交叉反应而影响实验结果），多色PRINS反应中每一个引物与靶序列的退火反应都在各自的最适温度下进行，从而保证了其特异性［15］。

2.2 同源基因定量PCR（HGQ-PCR） HGQ-PC法设计一对公用引物，同时扩增一对同源基因，产物经琼脂糖凝胶电泳分离，经扫描后用软件分析，检测这两个同源基因的PCR扩增产物的相对比值并统计分析其变异范围，可以检测出非整倍体中增加的染色体的基因拷贝。

王谦等［16］针对178名正常人和38名唐氏综合征患者，用该法同时扩增21号染色体唐氏综合征致病关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因（PFKLCH21）和位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM-CH1），2组研究对象的同源基因比值差异有统计学意义。

该方法需要使用光密度扫描仪，快捷、较QFPCR法费用低廉。除PCR循环周期外，DNA质量是影响PCR扩增的主要因素。如果DNA质量太差，将仅能扩增出较小的PFKL基因片段，而较大的PFKM基因片段扩增失败［17］。

3 定量PCR

3.1 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR） 实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。而在非整倍体的诊断中多采用比较阈值法实现定量测定而无需制作标准曲线，即在同一个反应体系中同时扩增目的基因和管家基因，反应结束后分别获得两基因的CT值，根据数学方法推导得出目的基因相对于管家基因的量。

高斌等［18］选择21号染色体上唐氏综合征特异区域基因片段（DSCR3）为目的基因，以12号染色体上的GAPDH为参照基因，设计引物以及分别以不同荧光标记的Taq Man探针，在同一个反应管中进行扩增。检测20例经细胞遗传学分析确诊为三体型的唐氏综合征患者血标本和30例正常血标本，分别获得患者和正常人的ΔCT值，两组数据间有非常明显的差异，且无交叉重叠。余蓉等［19］应用该技术扩增12号染色体上GAPDH基因、21号染色体上S100B基因和DSCR1基因，比较得病例组与对照组ΔCT值有统计学意义，且病例组低于对照组。Jerome等［20］同时扩增非多态性目的基因DSCR1和内参基因CFTR（囊性纤维化跨膜调节蛋白），然后计算两基因的比值，在154例羊水标本中共检测出2例21-三体，所有标本的检测结果均与核型分析一致。Tomoko等［21］同时扩增目的基因钾离子电压门控通道基因（21q22.12）和内参基因核糖体磷蛋白基因（18q21.1），然后计算2基因的ΔCT值，唐氏综合征的ΔCT值明显高于正常对照组，且两者间无重叠。

比较阈值法多选用非多态性的遗传标记（不同于QF-PCR中常用的STR位点），因此不必寻找基因上的多态片段，只需要一对探针标记的引物即可；但与此同时又带来一个缺陷，那无法鉴别标本中的母血污染。此外，该法简单（设置管家基因作为内参照，省去了制作标准曲线的复杂过程，满足了对原始模板的定量需要）、成本低、通量大，但需优化条件使目的基因和参照基因的扩增效率一致［22］。该法可以诊断三体型和易位型患者，但是对平衡易位患者（因为基因总量不变）、嵌合型患者难以明确诊断，需要进一步研究、完善。

3.2 定量荧光PCR（Quantitative Fluorescence PCR，QF-PCR） QF-PCR法通过荧光标记的引物，PCR扩增DNA样本，经毛细管电泳分离扩增产物。根据内标（相当于DNA marker）的指示，软件自动计算出检测片段的信息（出峰时间、片段大小、峰高、峰面积及根据横坐标的出峰位置），并通过点击每个检测峰而显示。由片段大小可判断出该峰所指示的是何种引物扩增出的标记物。根据峰个数、峰高、峰面积值就可判断出该标记物指示的染色体数目。多选用杂合度、特异性高的STR位点作为遗传标记。若为杂合子，显示为2个峰，定量之比为1：1；若为纯合子，显示为1个峰，其定量值为正常对照的2倍。

江帆等［23］针对21号染色体上特异的3个STR位点（D21S1435、D21S1411、D21S11），X 染色体上的两个STR位点（DXS981、DXS6809），X、Y 染色体上共有的STR位点X22及性别特异性位点AMXY设计引物，引物的5端标记荧光，对202份外周血标本提取基因组DNA进行七重定量荧光PCR扩增，使用ABI310测序仪进行PCR结果分析，根据国际统一判断标准进行结果判断，与染色体核型诊断结果具有同一性。Celia等［24］对2000年6月至2004年3月英国泰姆地区接受遗传服务的8 983例标本进行了QF-PCR，共检测出18例嵌合体，含3例13-三体、7例18-三体、7例21-三体、1例嵌合三体。他们同时还发现联用核型分析和QFPCR比单用其中任一方法能检测出更多的嵌合体。

QF-PCR法常选用高度多态性的STR位点作为遗传标记，当胎儿在某位点上为纯合子时，实验结果无法提供诊断信息，此时就应增加位点数以满足诊断需要。Levett等［25］开展的一项含有5 000份羊水标本的前瞻性研究发现，约2%的标本在某一个染色体上有7～8个位点均表现为纯合子，因此无法明确诊断。此外，该方法诊断染色体异常疾病的灵敏度高、特异性强，可以分析出异常染色体的双亲来源，判断异常染色体是来源于减数分裂1期还是减数分裂2期［26］。羊水中常见的少量母血污染并不影响QF-PCR，而大量的母血污染可能掩盖胎儿的基因型。Celia等［24］认为当异常细胞株的比例不小于15%时，QF-PCR才能检测出嵌合体的存在。

3.3 数字PCR（digital-PCR） 数字PCR将DNA样本稀释后分装到芯片的每个孔中，其平均含量少于一个拷贝。数字PCR通过计数从单个模板分子扩增而来的DNA量实现精确定量测定，反应后产生阳性信号的孔数与原始样本中的DNA模板分子数相关。

Christina等［2］从正常细胞株和21三体细胞株中提取人类基因组DNA，随后分别以不同比例混合2个基因组，针对21号染色体上的淀粉样蛋白基因以及12号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因设计特异性引物和Taqman探针，适当稀释后的DNA模板加载于微流控芯片，在荧光成像热循环系统上进行40个循环的两步法PCR。反应结束后计数阳性信号的孔数，可得出在正常人中2基因的比值为1∶1，21-三体病例中2个基因的比值为3∶2。

该法不具有其他分子技术的局限性，比定量PCR的精确度更高，受扩增效率波动的影响较小，不依赖于等位基因的分布，即使是嵌合体和母血污染的DNA都可以检测到信号［2］，可用于检测任何一种非整倍体疾病。

4 小结

综上所述，各种基于PCR的定性、半定量、定量技术广泛应用于常见非整倍体疾病的快速诊断，每种方法都各有利弊。目前，国内的文献中涉及的诊断方法多采用STR-PCR法、QF-PCR等，国外开始有应用数字PCR的文献报道，但仍以QF-PCR的应用更为普遍。数字PCR能够提供更多的诊断信息，结果的可靠性将会更高，成本也更高一些，值得进一步的应用研究。

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