结核杆菌潜伏感染小鼠模型的制备及其评价指标

师长宏

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

结核杆菌潜伏感染小鼠模型的制备及其评价指标

师长宏

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

目前对于结核分枝杆菌进入潜伏期的机制以及再激化的原因知之甚少，一个重要的原因是缺乏潜伏感染(LTBI)动物模型，完整的LTBI模型应包括两种类型，一是低剂量荷菌的持续性感染模型，另一种为潜伏感染模型，即Cornell模型的改进型。综合使用柯氏量表评分、脾肺荷菌数、诱导的 IFN-γ和 TNF-α水平、组织中 IL-10和 IL-4的表达、脏器中特异性抗原负荷以及激素诱导 TB复发的时间、潜伏感染相关基因的表达水平等指标可以比较准确、客观、特异性的评价小鼠LTBI模型的反应性。

潜伏感染;模型;评价

WHO公布的数据显示，全球约有1/3人口处于结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)感染状态，其中5% ～10%的感染者有可能发展为活动性结核［1］(tuberculosis，TB)，而 90%以潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)形式存在，形成无临床症状的隐性感染者［2］。LTBI不同于急性感染，病因复杂，病程长，目前对于MTB进入潜伏期的机制以及再激化的原因知之甚少，一个重要的原因是缺乏标准化的LTBI动物模型，对模型的反应性缺乏准确、客观、灵敏的评价指标。本文就LTBI小鼠模型的制备方法及特异性评价体系的建立进行了综述。

1 小鼠LTBI模型

MTB感染机体后，一方面通过诱导T细胞产生Th1型细胞因子(如 IFN-γ)，活化巨噬细胞，增强其杀灭MTB的能力，从而起到保护性免疫作用。另一方面，Th2型细胞因子可通过抑制Th1型细胞因子，降低巨噬细胞杀灭MTB的能力，从而削弱MTB的免疫应答［3］。这种 Th1型/Th2型细胞因子的动态平衡可有效控制MTB的感染，但平衡一旦被打破，将会导致TB的发生与发展。其中，Th2型细胞因子与MTB的感染程度密切相关，在活动性肺结核模型中，Th2型细胞因子特别是 IL-4的产生随着病程的进展和加重不断增加，但治愈后Th2型细胞因子水平降低［4］。在 LTBI模型中，肾上腺皮质激素可用于诱导TB的复发，其主要原因就是诱导了Th2型的免疫反应，因此一个良好的MTB动物模型应体现出随着病程的发展向Th2型反应的转化，小鼠就可以较好的反应机体这种免疫应答模式的变化，但不同品系的小鼠对MTB感染的反应存在明显差异。研究发现，低剂量(200 CFU)的MTB感染C57BL/6J小鼠，就可以引起急性病变［5］，这主要是诱发了强烈的Th1型细胞免疫反应，加重了肺的实变，最终还没有转换到 Th2型细胞因子的表达［6］，动物就死亡，而传统使用的BALB/c小鼠用于LTBI研究也存在一些问题，主要是BALB/c小鼠的TB模型过于偏向Th2型的免疫应答，往往呈现出严重的结核病变，不能准确观察到持续性感染的状态［7］。当尝试使用C57BL/6J×DBA/2F1代杂交鼠制备 LTBI模型，可有效克服单个近交品系复制LTBI模型的缺点［8］。

结合TB的临床特征，小鼠LTBI模型应包括两种类型，一是低剂量荷菌的持续性感染模型，存在少量的肉芽肿，小的肺泡炎症，模型鼠体重持续增加，肺脏中有稳定的CFU，但无临床症状，无自发性疾病复发。模型复制时采用103CFU的 H37RV，气管内感染C57BL/6J×DBA/2F1代小鼠，3月后便可获得稳定的慢性持续性感染模型［8］。另一种为潜伏感染模型，即 Cornell模型的改进型，用 104CFU H37Rv毒株经尾静脉感染 C57BL/6小鼠。4周后用抗结核药物 INH(85 μg/L)和 RIF(50 μg/L)加入饮水中持续治疗 l2周，即为典型的潜伏感染模型，小鼠无临床症状，脾肺无荷菌数，停药4～6周后使用120 μg的地塞米松肌内注射，隔天1次，持续14 d便可诱导TB复发［9］。这两种模型联合起来完整再现了临床TB患者持续性感染的两种状态，可用于LTBI发病机理和治疗性药物的研究。

2 评价LTBI小鼠模型反应性指标

用于评价LTBI模型反应性最简捷、最经典的指标为脾、肺荷菌数以及脏器的病理学改变［10］。对于潜伏感染模型中无法获得的脏器荷菌数可选择地塞米松诱导TB复发的时间，以及复发后的脏器荷菌数，但这些指标的特异性和准确性有限。MTB作为一种局限性感染，结核的控制主要取决于感染机体免疫系统多种细胞成分的配合和多种前炎和抗炎细胞因子的协调作用。对MTB感染的应答反应，一般需要多种细胞因子来调节细胞介导的组织损伤，同时，还需要对多种细胞因子的调节以有效清除病原体［11］。这样作用的结果往往体现出一种综合效应，可能使组织的荷菌数减少了，但诱导的免疫反应却加重了组织的病理损伤，因此必须综合运用多种指标评价LTBI小鼠模型的反应性，具体包括:

2.1 动物的大体观察

包括动物的体重，饮食状况、被毛色泽，活动能力和行为学变化。结合临床患者柯氏量表Karnofsky performance status［12］，我们实验室制订了符合小鼠MTB模型的柯氏量值以供参考。整体小鼠反应分6级，0级体征为毛色光滑，受轻度激惹活动正常，反应迅速，维持正常频繁的穿梭移动及嗅探活动，眼睛有光泽，巴氏分数为90～100。1级体征为毛色略显不顺，受激惹反应变慢，无频繁穿梭移动及嗅探活动，正常饮水进食不受影响，无昏睡，无共济失调，巴氏分数为70～90。2级体征为毛色明显不顺，无光泽，出现竖毛，发干，眼睛无神，昏睡症状，活动明显减少，对激惹反应明显变慢，饮水进食受限体型显瘦小，巴氏分数为50～70。3级体征为毛色灰暗、倒竖或出现明显掉毛、结块等，对激惹基本无反应，处于角落，笼内驱赶仅缓慢移动躲避，基本没有额外活动，精神萎靡，眼睛发干，发红，有明显的昏睡症状，明显的共济失调，饮水进食明显受限，体型明显瘦小，巴氏分数为30～50。4级体征为毛色灰暗或出现斑秃，对外来刺激无反应，躯干弯曲，笼内驱赶无反应，体型瘦小，呼吸急促，巴氏分数为10～30。5级体征为濒死状态或死亡，巴氏分数为0～10。

2.2 PPD实验

即结核菌素试验。是基于Ⅳ型变态反应原理的一种皮肤试验，可用来检测机体对结核杆菌的反应性，若LTBI小鼠模型被诱导激活，开始呈现活动性反应，则局部表面皮肤出现红肿硬节，随着体内MTB数量的增加，硬结直径变大;当体内结核杆菌处于潜伏感染状态，则注射局部无变态反应发生［13］。

2.3 脾、肺荷菌数

取LTBI小鼠的肺、脾组织研磨后在7H10培养基培养4周以上，计数脏器荷菌数以确定动物的感染程度。对于潜伏感染模型中无法获得的荷菌数，可选择地塞米松诱导TB复发的时间，以及复发后的脏器荷菌数，作为模型复制成功的指标，也可用作LTBI疫苗和相关药物治疗效果的评价［10］。

2.4 免疫学指标

Th1 细胞以分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α 为特征，主要参与细胞介导的免疫反应并在抵御MTB感染方面起着重要作用。在Th1型细胞因子活化巨噬细胞的过程中，IFN-γ和TNF-α起着关键的作用，他们能促进巨噬细胞的活化，诱导iNOS的表达［14］。在LTBI的小鼠肺中，肉芽肿和肺泡中有大量的Th1型细胞因子，高表达IFN-γ和TNF-α，而IL-4处于很低的水平，这种免疫状态是诱导和维持潜伏感染的重要因素。已有实验发现潜伏感染的小鼠在接受TNF-α中和抗体后能够使 TB复发，说明 TNF-α在维持潜伏感染中起重要作用［15］。基于此，机体诱导的 IFN-γ和TNF-α水平、组织中 IL-10和 IL-4的表达水平可以综合反映LTBI小鼠模型的反应性。

2.5 形态学指标

包括脾、肺组织的HE染色和抗酸染色，前者主要是观察脾、肺的病理学变化，包括组织结构是否完整，淋巴细胞的浸润，肉芽肿和单核巨噬细胞的形成等，后者观察感染组织中的 MTB数量和形态，这些形态学指标主要用于评价LTBI感染诱发的组织结构损伤［16］。

2.6 抗原负荷

LTBI小鼠诱发的免疫反应可使机体内MTB相关抗原负荷发生改变。当活动性TB发展为潜伏感染时，分枝杆菌抗原和(或)细菌残留减少，随着抗原负荷进一步降低，肉芽肿性炎症和纤维化的范围的相应减少，提示有效清除感染部位的长期的抗原残留对于肉芽肿损害消退是必须的。因此可通过免疫定位的方法测脏器中特异抗原负荷来确定LTBI小鼠的转归，激活和持续感染［17］。

2.7 潜伏感染相关基因的表达水平(hspX和icl)

MTB潜伏感染的存在主要是由于它具有逃避巨噬细胞吞噬和杀灭作用，细菌呈休眠状态，这可能与MTB中一些基因的表达有关。目前，MTB潜伏感染的相关基因并不是很明确，研究发现体外长期处于乏氧和非增值状态的结核毒株H37Rv细胞壁增厚，定位于细胞壁的编码α晶状体球蛋白的hspX基因高度表达，最多可达到整个菌体蛋白的25%，这是MTB休眠和应激时的一种表现，可能是MTB能以休眠状态长期存在的主要原因［18］，因此可将hspX蛋白作为MTB休眠菌的标志物。除hspX外，异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是迄今发现与MTB潜伏感染较为相关的因子，它是 MTB在潜伏感染状态下利用碳源的关键酶。MTB一般通过三羧酸循环代谢糖类生存，而处在休眠状态时则主要通过乙醛酸循环途径代谢脂肪酸维持生存。ICL为MTB乙醛酸代谢途径的关键酶之一，催化异柠檬酸裂解为琥珀酸和乙醛酸。研究表明，当MTB处于潜伏状态或被巨噬细胞吞噬后，其ICL的表达水平显著升高［19］。因此在MTB急性感染和休眠菌转化过程中，通过检测组织中hspX和icl基因表达水平的变化可以间接判断细菌的休眠菌状况，判断MTB潜伏感染的变化。

综上所述，理想的小鼠LTBI模型应能够充分模拟临床TB患者持续性感染状态;使用柯氏量表得分、脾肺荷菌数、诱导的 IFN-γ和 TNF-α水平、组织中IL-10和 IL-4的表达、脏器中特异性抗原负荷以及激素诱导TB复发的时间、潜伏感染相关基因的表达水平等相关指标可以比较准确、客观、特异性的反映LTBI感染的发生发展和变化。

［1］ WHO Report 2007.Global tuberculosis control:surveillance，planning，financing.World Health Organization.

［2］ Kobashi Y，Shimizu H，Ohue Y，et al.Comparison of T-cell interferon-gamma release assays for Mycobacterium tuberculosisspecific antigens in patients with active and latent tuberculosis.Lung［J］.2010，188(4):283-287.

［3］ Shi C，YuanS，ZhangH， etal.Cell-mediated immune responses and protective efficacy against infection with mycobacterium tuberculosis induced by Hsp65 and hIL-2 fusion protein in mice［J］.Scand J Immunol.2009，69(2):140－149.

［4］ Seah GT，Scott GM，Rook GA，et al.Type 2 cytokine gene activation and its relationship to extent of disease in patients with tuberculosis［J］.J Infect Dis.2000，181(1):385－389.

［5］ MancaC， Tsenova L， Barry C， etal. Mycobacterium tuberculosis CDC1551 induces a more vigorous host response in vivo and in vitro，but is not more virulent than other clinical isolates［J］.J Immunol.1999，162(11):6470－6478.

［6］ North RJ.Mice incapable of making IL-4 or IL-10 display normal resistance to infection with Mycobacterium tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol.1998，113(1):55－68.

［7］ Arriaga AK，Orozco EH，Aguilar LD，et al.Immunological and pathological comparative analysis between experimental latent tuberculous infection and progressive pulmonary tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol.2002，128(2):229－237.

［8］ Rivas-Santiago B，Contreras JC，Sada E，et al.The potentialrole of lung epithelial cells and beta-defensins in experimental latent tuberculosis［J］.Scand J Immunol.2008，67(5):448－452.

［9］ Repique CJ，Li A，Collins FM，et al.DNA immunization in a mouse model of latent tuberculosis:effect of DNA vaccination on reactivation of disease and on reinfection with a secondary challenge［J］.Infect Immun 2002，70(7):3318－3323.

［10］ Shi C，Wang X，Zhang H，et al.Immune responses and protective efficacy of the gene vaccine expressing Ag85B and ESAT6 fusion protein from Mycobacterium tuberculosis［J］.DNA Cell Biol，.2008，27(4):199－207.

［11］ Arriaga AK，Orozco EH，Aguilar LD，et al.Immunological and pathological comparative analysis between experimental latent tuberculosis and progressive pulmonary tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol，2002，128(2):229－237.

［12］ Kiwuwa MS，Charles K，Harriet MK.Patient and health service delay in pulmonary tuberculosis patients attending a referral hospital:a cross-sectional study［J］.BMC Public Health.2005，24(5):122.

［13］ Girlanda S，Mantegani P，Baldissera E，et al.ELISPOT-IFN-gamma assay instead of tuberculin skin test for detecting latent Mycobacterium tuberculosis infection in rheumatic patients candidate to anti-TNF-alpha treatment［J］.2010:20. ［Epub ahead of print］

［14］ Nemeth J，Winkler HM，Karlhofer F，et al.Cells co-producing Mycobacterium tuberculosis-specific type 1 cytokines for the diagnosis of latent tuberculosis［J］.Eur Cytokine Netw.2010，21(1):34－39.

［15］ Chakravarty SD，Zhu G，Tsai MC，et al.Tumor necrosis factor blockade in chronic murine tuberculosis enhances granulomatous inflammation and disorganizes granulomas in the lungs［J］.Infect Immun.2008，76(3):916－926.

［16］ Shi C，Zhang H，Wang L，et al.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin 2 fusion gene［J］.Tuberculosis(Edinb).2009，89(1):54－61.

［17］ Jain R， DeyB， DharN， etal. Enhanced and enduring protection against tuberculosis by recombinant BCG-Ag85C and its association with modulation of cytokine profile in lung［J］.PLoS One.2008，3(12):e3869.

［18］ Shi C，Zhang H，Zhang T，et al.New alternative vaccine component against Mycobacterium tuberculosis— heat shock protein 16.3 or its T-cell epitope［J］.Scand J Immunol.2009，69(11)465－474.

［19］ Sriram D， YogeeswariP， Senthilkumar P， etal. Novel phthalazinyl derivatives:synthesis，antimycobacterial activities，and inhibition of Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase enzyme［J］.Med Chem.2009，5(5):422－433.

Establishment of Latent Tuberculosis Infection Animal Model and Its Evaluation Indexes—A Review

SHI Chang-hong
(Laboratory Animal Centre，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China)

For lacking of latent tuberculosis infection(LTBI)animal models，researchers have little known about the mechanism of M.tuberculosis infection developing into latent phase and reactivating to disease.A sound mouse model for LTBI should contain two types:low-dose of persistent infection model and latent infection model，also known as the modified Cornell model.Many indexes can be used to exactly，objectively and specifically evaluate the reactivity of LTBI model，such as necropsy pathology scores，bacterial burden of spleen and lung，the induced levels of IFN-γ and TNF-α，expression levels of IL-10 and IL-4，burden of specific antigens in organs，time of TB reactivation after hormone injection，and the expression of latent-correlated genes.

LTBI;Mouse model;Evaluation;M.tuberculosis

Q95，Q891

A

1005-4847(2010)06-0538-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.020

2010-08-02

国家“863”专项课题(2007AA02Z473);国家自然科学基金(NO.30972767);陕西省自然科学基金(SJ08C203)。

师长宏(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:感染性疾病动物模型.E－mail:changhong@fmmu.edu.cn.