植物耐盐基因工程研究进展

化 烨，才 华，柏 锡，李 勇，纪 巍，季佐军，朱延明

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

全世界有超过800万hm2的土地受到盐害的影响，其数量占到世界总耕地面积的6%。由于过度开荒和灌溉，相当大比例的农业用地开始盐渍化，预计在未来25年内，将会有30%的耕地流失，到21世纪中期这个数字将会达到50%[1]。根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.5438亿hm2，其中我国为9913万hm2。我国碱土和碱化土壤的形成，大部分与土壤中碳酸盐的累积有关，因而碱化度普遍较高，严重的盐碱土壤地区植物几乎不能生存[2]。而通过传统育种的方法来提高作物的耐盐性能够获得的效果是非常有限的，这主要由于植物的耐盐性在分子及生理水平上都是由复杂的机制来调控的[3]。在分子水平上，植物的耐盐性通常具有多基因性状的特点，而在生理水平上，盐土植物和具低耐盐性的植物也显示出很大范围的适应性，这给传统育种工作带来很大的困难。基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的耐盐性，它是在基因水平上提高植物耐盐性，更具有精确性和稳定性，提高了育种的高效性，极大地加快了育种速度，对于我们了解耐盐植物复杂的性状以及耐盐机制也是非常必要的。随着分子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的耐盐性已经受到越来越广泛的关注和重视。如何挖掘耐盐基因和培育耐盐优质的农作物将是耐盐分子育种的主要任务。本文就耐盐相关基因的挖掘、各类耐盐基因的应用与植物耐盐基因工程研究的现状进行了分析，从而对植物耐盐基因工程研究提供一定的参考价值和指导意义。

1 盐胁迫信号传导通路研究进展

当盐胁迫来临时，植物细胞膜上的受体最先接受胁迫信号，然后将信号向下游传导，产生第二信使，包括钙离子、活性氧（ROS）和肌醇磷酸盐（见图1）[4]。这些第二信使，如肌醇磷酸盐，进一步调节细胞内钙离子的水平。钙结合蛋白，又称为钙离子传感器，能感知胞浆内钙离子水平的改变。这些传感器分别与各自下游的分子相互作用，激活蛋白磷酸化的级联反应，最终引起功能蛋白表达或者由转录因子控制的特定种类基因的表达。这些基因的表达产物使植物能够适应不利的环境条件并正常生长。由此可见，植物单个细胞对于胁迫的响应就像是一个完整的有机体一样协调。胁迫诱导不仅使基因的表达发生了改变，还促进了一些植物激素（如脱落酸，水杨酸和乙烯）的产生。这些分子能够扩大胁迫反应最初的信号，并引起下一轮的信号传导，这种信号传导可能遵循与之前相同的路径，或者是完全不同的信号传导通路。辅助分子（例如修饰蛋白）可能没有直接参与信号传导过程，但它们却参与了信号元件的修饰或组装，并能够附着在信号蛋白上与其协同作用。这些辅助分子包括豆蔻酰化酶、糖基化酶、甲基化酶和泛素化酶等。

目前已阐明与盐胁迫信号传导途径相关的有促细胞分裂剂激活性蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，maPK）信号传导途径、盐超敏感（Salt overly sensitive，SOS）信号传导途径以及其他蛋白激酶参与的信号传导途径[5]。在真核生物中存在maPK级联途径，其中包括3个功能上相互联系的蛋白激酶，maPK被maPK激酶（maPKK）磷酸化而激活，maPKK又被maPK激酶激酶（maPKKK）磷酸化而激活。柏锡等将OsmaPK4基因整合到水稻基因中[6]，发现转基因水稻种子在含0.2 mol·L-1NaCl的培养基上能够正常萌发；转基因水稻幼苗在0.4 mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色，种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株。迄今已从多种植物中分离到了maPK基因，并发现maPK级联途径与植物对干旱、高盐、低温、激素（乙烯、脱落酸、赤霉素、生长素）、创伤、病原反应、氧化反应以及细胞周期调节等多种信号传导途径有关[7]，但各途径之间的相互关系还需进一步研究。Zhu等通过突变和耐盐筛选[8]，从拟南芥中筛选到一系列SOS突变株，发现了一个全新的植物盐胁迫信号传导途径。这些SOS突变体分属5个等位基因群，即 SOS1～SOS5，其中 SOS1、SOS2和SOS3在同一信号传导途径中起作用[9]，SOS2的活化和SOS2与SOS3的相互作用都需要Ca2+的参与[10-11]，SOS3-SOS2除了直接对SOS1进行磷酸化[12]，还能够调节SOS1的表达，随后的研究还发现SOS3-SOS2还可能调节其他盐胁迫效应器的表达[13]。蛋白激酶在胞内调节和细胞信号传导中也扮演了重要角色，它是位于细胞膜上的受体蛋白激酶，不仅能够感受外界胁迫信号，还参与胞内信号的传导。依据磷酸化氨基酸的种类可将蛋白激酶分为3类，即酪氨酸蛋白激酶、组氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，maPK即为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。除maPK外，其他类型的蛋白激酶也参与了盐胁迫的信号传导，主要包括钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（Calcium-dependentand calmodulin-independent protein kinase，CDPK）、受体蛋白激酶、GSK3/shaggy激酶和组氨酸激酶等。除上述几种蛋白激酶外，还有其他蛋白激酶如核糖体蛋白激酶、转录调控的蛋白激酶等。

在盐胁迫信号传导通路中涉及到生理代谢、细胞防御、能量产生和运输、离子转运和平衡、细胞生长和分裂等诸多方面的相关的基因,还有很大一部分至今未知其功能。这些基因以某种协调的机制发挥作用，维持盐胁迫下植物正常的生长发育。

2 植物耐盐相关基因的研究

植物受到非生物胁迫时，很多基因和它们的表达产物在转录和翻译水平对此做出响应。了解这些响应胁迫基因的功能，将有助于阐明植物胁迫耐受机制，从而更准确、更稳定地将这些基因应用于耐盐基因工程中。

2.1 植物耐盐相关基因的挖掘

2.1.1 基于EST数据库的基因挖掘

通过构建胁迫处理各种作物的cDNA文库，获得了大量的表达序列标签（ESTs），从而识别非生物胁迫相关基因[14]。在植物生长发育的不同阶段，胁迫处理提取作物不同部位组织的mRNA，构建cDNA文库，并对其进行测序来丰富EST数据库。通过对EST数据库的不断完善，已将水稻和拟南芥基因组序列信息补充完整，为基因挖掘提供了宝贵的资源。对cDNA文库中EST序列进行拼接，更为我们提供了关于胁迫反应中相关基因的数量、基因组成和可能的基因家族数量等相关信息。同时，胁迫响应基因通过BLASTX与Swissprot数据库进行比对，对它们进行注释，可以将不同物种中胁迫响应的基因联系起来。这样，拼接过程中的一致序列提供了比单个EST数据更清晰的数据组。研究表明，在所有胁迫处理的cDNA文库中，未知基因仍然占有非常高的比例（20%～30%）。注释这些未知功能的基因，能够绘制出一个更完整的植物胁迫应答机制的轮廓。Wang等通过建立盐胁迫条件下盐芥的cDNA文库[15]，发现了盐胁迫下超量表达的ESTs。Sreenivasulu等在单子叶植物，例如大麦、小麦、玉米和水稻中也进行了类似的工作，发现了盐胁迫相关的ESTs，并对耐盐相关基因进行挖掘[16]。同时，在挖掘这些基因的过程中，我们也会得到关于植物胁迫耐受基本调控和代谢网络的启示。

2.1.2 通过转录谱确定胁迫响应的基因

对比基于ESTs的基因组学方法，SAGE、MPSS、基因芯片技术和实时定量PCR（qRT-PCR）能够定量分析胁迫处理植物的各个发育阶段不同组织中高通量表达的基因，而想要了解基因表达的类型和功能可以通过基于EST的cDNA芯片来实现。基因表达谱利用cDNA芯片可以鉴定更多与胁迫耐受机制相关的转录产物和传导通路。通过对基因转录水平的研究，来鉴定更多胁迫响应的基因。在不同物种甚至同一物种不同的基因型中，基因对于胁迫的响应也是不同的，因为某些基因型具有高效的信号感知能力并且在转录水平上发生改变，使它们对胁迫环境具有适应性和完全的耐受性。当然，不同的胁迫类型和胁迫程度，基因的表达也是不相同的。Kawasaki等报道了在高盐条件下，水稻盐耐受型品种Pokkali和盐敏感型品种IR29在胁迫15 min后到第7天的基因表达谱，发现盐耐受的栽培品种在转录水平上的响应在盐胁迫15 min以后就发生了，并且表现出许多基因的上调表达，包括甘氨酸丰富蛋白、ABA和胁迫诱导蛋白、金属硫样蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、抗坏血酸过氧化物酶、水通道蛋白亚基、枯草杆菌蛋白酶抑制剂和酪氨酸酶抑制剂等等[17]。他们还发现在盐处理过程中，许多耐盐品种中上调表达的转录产物的响应速度比在盐敏感的栽培品种中要慢。同样，Sreenivasulu等观察盐耐受型与敏感型谷子的幼苗在250 mmol·L-1NaCl胁迫下基因表达类型，发现14个特定的ESTs在盐耐受型的谷子株系中上调表达，并且延长盐胁迫时间，仍然得到相同的结果[18]，这与Kawasaki等在水稻中得到的结果是一致的[17]。据此，学者们认为，在长时期的非生物胁迫处理过程中的谷类植物，它的蛋白酶抑制剂、应激蛋白、水通道和抗氧化剂成分是能够被诱导的，并推测这些成分在植物抵抗不同非生物胁迫处理的过程中起着重要的作用。此外，目前应用转录组学研究的一个重要方面就是根据多种胁迫相互作用下基因表达的类型来确定胁迫响应过程中关键的调控因子。基因组范围内的转录组学分析已经确定了成百上千的编码转录因子的基因，这些转录因子是由许多环境胁迫诱导得到的或者响应这些胁迫信号的[19]。转录因子的表达类型是高度复杂的，因此植物对于非生物胁迫的耐受力和抵抗力是由一个非常复杂的基因调控网络控制的。通过研究在非生物胁迫来临时转基因植物或者敲除突变体在转录水平上的变化，能够确定基因间相互作用及其下游元件。Seki等在拟南芥超表达DREB1a基因的转录谱（1300个基因）中，确定有12个冷和干旱诱导的基因是DERB1转录因子家族的靶基因[19]。

2.1.3 应用高通量基因失活技术确定基因在非生物胁迫中潜在的功能

尽管目前应用基因组学技术来挖掘基因还在继续进行，但鉴定非生物胁迫响应候选基因的任务量还是很大，并且超过40%～50%的已知基因的功能仍然不确定。为了揭示他们在非生物胁迫耐受中可能的功能，也可以通过基因失活的高通量方法或突变体筛选来确定并阐释基因的功能。目前有两个主要的互补方法来确定目的基因的突变体，分别为TILING和T-DNA插入。这两种方法已用来挖掘拟南芥、水稻、玉米和大麦中非生物胁迫响应基因的潜在功能。Zhu等通过常规遗传筛选，获得了拟南芥sos突变体，该突变体显示出对于NaCl胁迫的高度敏感，并且生长受到了抑制[20]。他们还发现sos突变体在缺K+培养基中生长会受到影响，并且对Na+和Li+离子也高度敏感。Shi等根据最近的生理生化数据，发现sos1在获得K+的过程中并不直接起作用[21]。通过鉴定，认为sos1是Na+/H+反向转运体，通过将Na+离子泵入液泡来维持细胞质中低浓度的Na+。

2.2 植物耐盐相关基因类别与应用

2.2.1 渗透调节物质合成酶基因

许多植物在失水胁迫条件下会积累小分子相容性溶质或渗压剂。导入渗透调节物质合成酶基因，使植物在水分胁迫下能合成更多的代谢产物（如脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、甘露醇、果聚糖、甘氨酸等），有利于提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的耐盐性。Garg等在水稻中超量表达细菌海藻糖合成基因，增加了水稻对盐的耐受性[22]:在100 mmol·L-1NaCl中培养4周，转基因植株的干重是未转基因植物干重的4倍。Abebe等在小麦中超量表达细菌甘露醇合成基因mt1D，能够增加小麦的耐盐性:在150 mmol·L-1NaCl中，缺失mt1D基因的植株芽鲜重减少了70%，而转基因植物只减少了50%[23]。Waditee等发现从甘氨酸到甜菜碱的生物合成途径，该途径由两个N-甲基转移酶催化[24]。N-甲基转移酶基因在甜菜碱合成过程中的潜在作用在淡水蓝藻和拟南芥中得到证实。研究发现，蓝藻中共同表达N-甲基转移酶基因会使甜菜碱在植物体内大量积累，并赋予淡水蓝藻耐盐性，使它能够在海水中正常生长。

2.2.2 氧胁迫相关基因

盐碱、干旱和低温胁迫同时伴随有活性氧（ROS）的产生。这些毒性分子破坏生物膜，尤其是破坏线粒体和叶绿体的膜系统，导致氧化胁迫。通过导入解毒酶和氧化胁迫相关酶的基因，如SOD、CAT和GST等，并使其过量表达，以有效地排除活性氧自由基，保护和稳定蛋白复合体和膜结构，从而提高细胞耐脱水的能力。Yoshimura等通过不同的抗氧化剂和ROS清除剂来减轻氧化损伤，增强植物对于盐和干旱的耐受性[25]。在细胞质和叶绿体中超量表达衣藻的谷胱甘肽过氧化物酶的转基因马铃薯显示出对氧化胁迫的耐受性，这种氧化胁迫多是由寒冷和盐胁迫造成的。Sunkar等在拟南芥中超量表达醛脱氢酶AtALDH3基因，通过消除细胞内的ROS，提高了拟南芥对于干旱和盐的耐受性[26]。

2.2.3 离子转运相关基因

Na+是盐渍土壤中主要的有害离子，在植物体中过量积累会破坏细胞膜结构、降低胞质酶活性、阻碍光合作用和代谢过程，引发离子胁迫。研究表明，在高盐环境下，Na+进入液泡主要依赖液泡膜Na+/H+反向转运蛋白以及液泡型H+-ATPase和H+-PPase基因表达的上调或活性的提高[27]。而胞质内过多的Na+排出胞外主要由质膜Na+/H+反向转运蛋白，利用质膜型H+-ATPase和H+-PPase产生的质子电化学梯度完成。Gaxiola等首先在拟南芥中克隆了编码液泡膜Na+/H+反向转运蛋白AtNHX1基因[28]，Xue等利用该基因在小麦中超量表达，使转基因小麦在中度盐渍土中的产量提高15%[29]。

2.2.4 编码转录因子的调节基因

转录因子在植物渗透胁迫反应中起关键调控作用，它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达，获得比单独导入某个功能基因更强的抗逆性。胁迫响应基因的启动子有几个典型的顺式作用元件，例如DRE/CRT、ABRE和MYCRS/MYBRS，它们受到各种上游转录因子的调控。在了解顺式作用元件的基础上，借助酵母单杂交的手段即可分离到与其结合的转录因子基因。现已有很多与DRE相结合的转录因子被分离出来，分别命名为 CBF1/DREB1B、CBF2/DREB/C和CBF3/DREB1A。研究表明，CBF类转录因子受低温诱导，可以提高植物对低温的抗性。而与其同源的DREB2类转录因子则受高盐、干旱调节，参与植物耐盐的信号传导过程。Park等将转录因子MsPRP2、SCOF-1、Tsi1基因导入苜蓿、烟草等，也可提高转基因植株对渗透胁迫的抗性[30]。

2.2.5 感应和传导胁迫信号的蛋白激酶基因

蛋白激酶是一类胞内信使依赖的、在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用，是信号传递中关键酶，它广泛参与植物对干旱、盐胁迫、ABA诱导、光诱导等的应答反应。Shou等在玉米中组成表达maPKKK/NPK1能够激活氧化信号级联系统，使转基因植物对低温、高温和盐具有耐受性[31]。Liu等发现了一种新的钙传感器CBL（钙调磷酸酶B细胞样）蛋白[32]。不同的CBL同工型在胁迫条件下都是上调的。并且CBLs特定的与一类称为CBL互作蛋白激酶（CIPKs）相互作用，通过磷酸化作用将信号传导给下游的信号元件。本研究室在野生大豆耐盐cDNA文库中筛选到CRCK基因，该基因的产物在Ca2+存在下能够与CaM结合，参与渗透胁迫信号传导过程。超量表达CRCK基因的拟南芥对高盐和ABA具有明显的抗性。现已将该基因通过农杆菌介导法转化大豆，并对抗性植株进行分子生物学检测及生物学检测，最终获得耐盐转基因大豆新品系。

2.2.6 解旋酶基因

非生物胁迫往往影响的是细胞基因表达机制，参与处理核酸的解旋酶也可能受到影响。大部分DNA解旋酶存在于细胞，并参与不同发展阶段基因的调控以及胁迫条件下的基因调控。这些DNA解旋酶可能有不同的底物以及构造的要求。虽然已经许多文献报道了大肠杆菌、噬菌体、病毒、酵母菌、小牛胸腺和人类的DNA解旋酶，但只有少数DNA解旋酶的生物学作用被揭示[33]。此外，我们关于植物DNA解旋酶的知识也很有限，只知道有6个被纯化的解旋酶蛋白。解旋酶的作用及分子机制现在才刚刚开始探索。目前，正在研究PDH45（豌豆的DNA解旋酶45）在盐胁迫耐受中的潜在作用[34]。已经证明，超量表达PDH45的转基因株系表现出较高的耐盐性。在连续的盐胁迫下，T1代转基因植株能够成长并产生正常的可育种子，根据种子的重量推算产量并没有任何削减[35]。最近，一个新的DNA解旋酶基因PDH47（豌豆的DNA解旋酶47）也已经被分离，并证明是受冷诱导表达的[36]。

2.2.7 其他调控序列

近年来研究发现一些小的非编码RNA，MicroRNAs（miRNA）和 siRNAs，它们是 mRNA 降解、转译抑制和染色质修饰的重要调控子。miRNA作用的靶基因包括代谢途径中的酶类基因、泛蛋白化途径中的酶基因、转录因子、信号传导组分和涉及RNA加工、蛋白质合成方面的基因。Sunkar等在已知的43个miRNA中鉴定发现4个miRNA在不同的非生物胁迫条件下表达发生变化[37]。由此可见，miRNA在植物对环境胁迫的应答中可能起重要的调控作用。同时，发现一些内源小RNAs也可能在植物对环境胁迫的应答方面起着重要的作用。

3 展望

非生物胁迫特别是盐胁迫，是世界范围内影响粮食产量的重要因素。应用植物生物技术包括分子辅助育种和基因工程手段提高作物的耐盐性是快速并且有效的方法。不同研究者从诸多方面对植物的耐盐机制作了大量研究，并已达到一定的广度和深度，但由于植物盐胁迫响应过程是一个多基因表达的结果，因此对任何一个基因进行操纵都可能导致大量相关基因和他们的产物发生改变。而在提高植物耐盐性的研究中，要尽可能的减少这些改变，不破坏植物的天然机制，适时的激活胁迫基因的表达。启动子和转录因子驱动、激活胁迫基因时，应在没有胁迫条件下尽量降低外源基因的表达量，基因的产物也应该针对适合的组织和细胞定位，控制表达的时间和丰度，从而不影响植物的生长发育，保证作物的产量。因此，在后续植物对盐胁迫耐受性的研究中，应该考虑到:①选用安全性较高的筛选标记基因；②盐、干旱、高温这几种胁迫耐受的机制是相互干扰的；③植物受到胁迫和从胁迫中恢复的周期是一个普遍的过程，也是与胁迫耐受密切相关的；④应观察长期胁迫对植物生长的影响，因为这种长期胁迫才更接近大多数作物的寿命。因此，对于作物实际耐受性的结论，必须包括生物量、产量和存活率等数据。

随着分子生物学技术和方法的不断发展和完善，植物耐盐生理和机理研究的不断深入以及转基因技术的发展，应将生物技术与传统的生物学和育种学充分的整合起来，在植物体内建立可受盐胁迫诱导表达的、比较完善的耐盐体系，为提高植物耐盐性探索出更可靠、更稳定的新途径，以更好地提高植物尤其是粮食作物的耐盐性。

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