大鼠股骨骨折合并脑外伤时早期骨愈合过程中 PDGF的表达

姜小华 张柳 王晓希

临床发现,骨折合并脑外伤的患者,相对单纯骨折患者,其骨痂的数量多、骨折愈合的速度快[1]。1987年 Perkins等[2]报道了这一现象,国内学者也通过动物实验验证了这一现象[3],但其作用机制仍未明确。近年来,细胞因子在脑外伤促进骨折愈合方面的研究日益受到重视。我们通过免疫组织化学染色和原位杂交技术,研究大鼠骨折合并脑外伤时血小板衍生生长因子(platelet-derived grow th factor,PDGF)含量的变化与骨折位点的表达,探讨 PDGF在脑外伤时骨折愈合过程中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 12周雄性 SD大鼠 32只,体重(356±25)g,购于北京大学医学部实验动物科学部。实验过程中于室温 20℃自然光照的动物房中分笼饲养,供给大鼠标准饲料,自用饮用水。定期紫外线消毒与排风。喂养 1周适应环境后随机分为 4组,每组 8只：A组为骨折合并脑外伤 1周组,A 1组为单纯骨折 1周组,B组为骨折合并脑外伤 2周组,B1组为单纯骨折 2周组。

1.2 主要试剂 PDGF多克隆抗体、HRP SPKit、PDGF-B多点标记的 DIG探针原位杂交试剂盒由天津灏洋生物制品科技有限责任公司提供。

1.3 模型制作 大鼠经 100ml/L水合氯醛(3ml/kg)腹腔内注射麻醉后,制作脑损伤模型[4]：常规去毛、备皮、碘伏消毒,显露右颅顶骨,中线旁 2mm处开直径 5mm骨窗,将 20 g砝码于 30 cm高处通过导向杆坠落,撞击置于硬膜上的圆锥致中度脑损伤。股骨干骨折模型的制作[5]：右下肢股外侧切口,沿股外侧肌间隙钝性分离至股骨干,在股骨干中 1/3用线锯断成横行骨折,然后以直径 1.5mm克氏针逆行从大粗隆穿出,复位后将克氏针顺行穿入股骨远端髓腔,确认牢固后,0.9%氯化钠溶液冲洗伤口,分层关闭切口,碘伏再消毒。肌内注射青霉素至术后 5 d(5万 U/d)预防感染。术毕分笼饲养。

1.4 标本采集与处理 分别将受试大鼠经水合氯醛腹腔内注射麻醉后,于术后第 1、2周心脏取血处死,每组 8只,取大鼠右侧完整的股骨标本,0.9%氯化钠溶液冲洗,摄CR片。在无菌条件下以骨痂为中心截取股骨中 1/3段(包括骨痂、皮质骨、骨髓成分),迅速去除周围软组织,将标本置入 4%的多聚甲醛液(DEPC水 +PBS配制)中固定过夜,PBS液冲洗后,置 20%EDTA(DEPC水配制)液中 4℃脱钙约 5周。取骨痂及周围组织依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋,备用(所用液体试剂均需用DEPC处理或DEPC水配制,接触标本及容器的洗涤均用 DEPC水。实验容器及器械在实验前 1天置高温烘烤,温度≥180℃,时间≥8 h)。

1.5 观察指标

1.5.1 计算机 X线摄像仪(CR)摄片：将大鼠完整的右侧股骨干骨折标本经 CR摄片(距离：90 cm,电压：40 kV,电流：3.2mA),观察大鼠股骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。

1.5.2 HE染色：制备 5μm石蜡切片,经脱蜡、水化、苏木素染核、盐酸酒精分化、伊红染浆、脱水透明,最后中性树胶封片,光镜下观察骨痂生长情况及其组织形态。

1.5.3 免疫组织化学染色：制备 5μm石蜡切片,常规脱蜡至水,3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶,5%山羊血清封闭非特异性抗原,加一抗(1∶100)于 4℃孵育过夜,滴加生物素化二抗,高敏过氧化物酶复合物,DAB显色,苏木素复染。每次染色均用PBS液代替一抗作为阴性对照。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色图像分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司),在400倍视野下,随机选取 6个视野,统计每个视野总的细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞百分数,以 6个视野的平均值作为此标本的 PDGF阳性细胞百分数。

1.5.4 原位杂交：制备 5μm石蜡切片 DEPC水捞片(杂交专用玻片),置 56℃烤箱过夜后脱蜡至水,室温置打孔液后10min,3%双氧水 20m in封闭内源性过氧化物酶,滴加复合消化工作液 30min,预杂交工作液 37℃湿盒孵育 1h,滴加杂交工作液 37℃湿盒孵育 4 h,滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液 37℃湿盒孵育 45min,高敏过氧化物酶复合物 37℃湿盒孵育 45m in,DAB显色,苏木素复染。每次染色均用寡核苷酸阴性探针杂交液代替杂交工作液作为阴性对照。采用HPIAS-1000高清晰度彩色图像分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司),在 400倍视野下,随机选取 6个视野,统计每个视野总的细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞百分数,以 6个视野的平均值作为此标本的 PDGFmRNA阳性细胞百分数。(操作时戴无菌手套,所用液体试剂均需用 DEPC处理或 DEPC水配制,接触标本及容器的洗涤均用 DEPC水。实验容器及器械在实验前 1天置高温烘烤,温度≥180℃,时间≥8 h。

1.6 统计学分析 应用 SPSS 11.0统计软件,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析和t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线片观察 在同一时间点骨折合并脑外伤组较单纯骨折组对位对线好,骨折端骨痂形成早,骨痂大,骨折愈合加快。见图 1。

图 1 X线片观察

2.2 HE染色 A组可见较多早期软骨细胞、成纤维细胞;A 1组骨折间隙可见成纤维细胞,仅夹杂有少量的早期软骨细胞;B组骨折端有新生骨小梁长入;B1组未见有骨小梁形成。

2.3 免疫组织化学染色 以细胞中含有明显的棕黄色颗粒者为阳性表达。术后 1周骨膜内增殖细胞、骨折端周围肉芽组织中的纤维母细胞、间充质细胞、血管内皮细胞、早期软骨细胞、成骨细胞胞浆均出现广泛的强阳性反应,合并脑外伤组阳性细胞数量多于单纯骨折组,并且显色强。图像分析显示,A、B组平均阳性细胞百分数均高于同一时间点 A 1、B1组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

2.4 原位杂交 以细胞中含有明显的棕黄色颗粒者为阳性表达。成纤维细胞、间充质细胞、血管内皮细胞、早期软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞胞浆在不同时间点分别出现广泛的PDGFmRNA表达,骨痂 PDGFmRNA含量在 2周表达增强,PDGFmRNA阳性细胞百分数比较且 A、B组骨痂 PDGFmRNA阳性细胞百分数均显著高于同一时间点 A 1、B1组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

表 1 4组 PDGF平均阳性细胞百分数和 PDGFmRNA表达水平比较n=8,%,±s

表 1 4组 PDGF平均阳性细胞百分数和 PDGFmRNA表达水平比较n=8,%,±s

注：与A 1组比较,＊P＜0.05;与B1组比较,#P＜0.05

组别 PDGF平均阳性细胞 PDGFmRNA平均阳性细胞A组 0.872±0.021＊ 0.385±0.046＊A1组 0.803±0.042 0.204±0.042 B组 0.781±0.036# 0.602±0.050#B1组 0.712±0.027 0.438±0.026

3 讨论

大量临床病例发现：骨折患者若同时伴有脑外伤,其骨折愈合过程明显加快,甚至在未见骨折的某些关节周围出现异位骨化现象[1-3]。本次实验CR片和HE染色发现发现合并脑损伤的骨折愈合明显好于单纯骨折组,表明脑损伤可以促进骨折愈合。关于脑外伤后加速骨折愈合的调节因素,国内外学者已开始在分子生物学水平进行研究,并逐渐认识到细胞因子的特殊作用[6-10]。我们的实验从蛋白水平和基因水平研究骨折愈合中骨痂 PDGF的变化,发现骨折合并脑外伤组 PDGF和PDGFmRNA表达均显著高于同一时间点单纯骨折组,PDGFmRNA在 1周时有阳性表达后逐渐增强,2周出现高峰表达,PDGF在骨折愈合过程中分别在不同细胞内呈强阳性表达。故我们的实验结果提示脑损伤促进了骨折局部 PDGF及 PDGFmRNA的表达,峰值上调。

骨折愈合是一个复杂的过程,受到各种因素的严格控制,其中起主要作用的是局部的骨生长因子或细胞因子。各种生长因子协同作用促进骨折的愈合,其中PDGF在成骨及骨重建过程中起着重要作用[11]。作为重要的有丝分裂原,PDGF可在创伤骨组织中高效表达,对成骨细胞的增殖、分化起重要作用：PDGF能够促进成骨细胞早期的 DNA合成,使成骨细胞从静止状态的 G0/G 1期进入到有复制潜能的 S期,使分泌期细胞增多;同时还能增强单核细胞、成纤维细胞的游走性,使局部成纤维细胞增殖、分化,从而促进骨形成[12]。在我们的研究中,免疫组织化学染色和原位杂交结果显示骨痂组织中有 PDGF及PDGFmRNA的表达,前者在 1周时就有高峰表达,2周仍持续强阳性表达,后者早期表达主要在新生毛细血管内皮细胞,2周时有高峰表达,提示PDGF早期可能以旁分泌形式启动后又刺激多种细胞自分泌并参与了骨折早期修复的过程。

我们的实验结果表明,脑外伤时骨折部位PDGF的表达增加,骨折愈合加速,PDGF可能在脑外伤加速骨折愈合中起了重要作用。此研究为临床促进骨折愈合,及骨折不愈合和延迟愈合、骨质疏松骨折的分子治疗提供重要参考依据。

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5 Li C,Mori S,Li J,et al.Long-term effect of incadronate disodium(YM-175)on fracture healing of femoral shaft in growing rats.JBone Miner Res,2001,16：429-436.

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10 王守君,张柳.大鼠股骨骨折合并脑外伤时骨愈合过程中 TGF-β1的作用.第四军医大学学报,2006,27：1407-1410.

11 Andrew JG,Hoyland JA,Freemont AJ,et al.Platelet-derived growth factor expression in normally healing human fractures.Bone,1995,16：455-460.

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