HP-20大孔吸附树脂分离纯化儿茶素EGCg的效果

龚志华，黄甜，庞月兰，肖文军*

（湖南农业大学 a.园艺园林学院；b.茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128）

茶多酚对茶叶品质的影响最显著[1]．自20世纪90年代后，随着“绿色化学”口号的提出，越来越多的学者致力于对茶多酚生产过程的精细化，其研究多集中于茶多酚的主体部分儿茶素（占茶多酚总量的70%～80%），尤其是儿茶素中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCg）．

EGCg是茶叶中的主要儿茶素之一，占茶多酚总量的40%～50%，作为天然抗氧化剂和自由基清除剂，具有明显的抗衰老、抗突变、防癌抗癌、预防心血管疾病、防辐射等多种生物学活性，广泛运用于食品加工、医药保健和日用化工领域[2-5]．是酯型儿茶素单体EGCg的分离纯化，成为儿茶素分离、纯化与临床应用研究的焦点．

分离儿茶素单体的过程[6]主要为：提取茶多酚粗品（TP）→分离儿茶素→纯化儿茶素单体．目前分离制备儿茶素单体的方法主要有柱色谱法[7]、柱色谱预分离-制备型 HPLC纯化法[8]、有机溶剂富集-柱色谱纯化、高效液相色谱法[9]、高速逆流色谱法（HSCCC）[10]、沉淀-吸附法[11]、有机溶剂萃取法[12]等，但在降低成本、提高得率、保持产物的天然活性以及实现工业化等方面依然存在技术瓶颈．

笔者以EGCg含量为35.52%的儿茶素粗提物为原料，应用近年出现的新型大孔吸附树脂HP-20对EGCg进行分离纯化试验，并对相关技术参数进行了优化筛选，以期为工业化生产制备高纯EGCg提供新途径．

1 材料与方法

1.1 材 料

70%小叶儿茶素（EGCg含量为31.52%，湖南金农生物资源股份有限公司产品）；HP-20、D202、XDA-1、D201、D900、LSA-7大孔吸附树脂（长沙市化学试剂玻璃仪器有限公司产品）．

1.2 方 法

（1） 树脂预处理．大孔吸附树脂上柱前，分别清洗干净，即采用95%乙醇浸泡充分溶胀→95 %乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象→去离子水洗尽乙醇后，以4倍体积3%NaOH溶液浸泡4 h→去离子水洗至pH值为中性→4倍体积3%HCl溶液浸泡4 h→去离子水洗至pH值中性．

（2） 原料液制备．按照每次试验的上样量将儿茶素粗提物溶于蒸馏水，配制成质量分数为20%的水溶液．

（3） 不同大孔吸附树脂的静态吸附与解吸效果比较．将经预处理的6种大孔吸附树脂去表面水，各精密称取1 g，置于具塞磨口锥形瓶中，分别加入50 mL的原料液，摇床振荡24 h，过滤，检测滤液中EGCg的含量，计算单位质量树脂对EGCg的吸附量，并将吸附饱和的树脂再各用50 mL 95%乙醇解吸24 h，检测解吸液中EGCg的含量，计算其解吸率，筛选对EGCg吸附与解吸具有最佳效果的树脂．

（4） 最佳吸附与解吸效果树脂的等梯度洗脱条件优化．以乙醇为洗脱剂，设计乙醇体积分数（20%、40%、60%等3个水平）、洗脱流速（0.5、1.0、2.0 BV/h等3个水平）、上样量（0.2、0.6、1.8 g等3个水平）、洗脱体积（2、4、6等3个水平）的正交试验[13-15]，优化筛选最佳树脂的等梯度洗脱参数．

（5） 最佳吸附与解吸效果树脂的连续梯度洗脱条件优化．以EGCg得率与纯度为考察指标，以上述试验中最佳等梯度洗脱技术参数为基础，保持流速、上样量、洗脱体积不变，分别以30%、35%、40%、45%、50%乙醇进行连续梯度洗脱，分段收集洗脱液至流出液无色时，换下一梯度进行洗脱，筛选连续梯度洗脱的最佳乙醇体积分数．以最佳乙醇体积分数、洗脱流速、上样量、洗脱体积为操作参数，将原料液重新上柱进行洗脱，每收集0.5 BV洗脱液作为一个样品，筛选EGCg得率、纯度综合效果较好的收集段．

EGCg含量采用高效液相色谱法测定．色谱柱：Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：278 nm；进样量：10 μL；流动相：采用二元梯度洗脱，A相为超纯水，B相为有机相（N,N-二甲基甲酰胺∶甲醇∶冰醋酸 = 80∶4∶3）；梯度条件：B相，0.01 min时17%、15 min时20%、28 min时32%、34 min时32%、36 min时17%、40 min时17%．

水浸出物含量测定采用全量法[16]．

EGCg纯度、EGCg得率计算参照文献[15]方法．

数据统计与分析采用正交设计助手IIV3.1.1软件进行．

2 结果与分析

2.1 不同大孔吸附树脂对 EGCg的静态吸附与解吸效果

HP-20、D202、XDA-1、D201、D900、LSA-7等6种大孔吸附树脂对EGCg的吸附量和洗脱率如表1所示．由表1可知，单位质量的HP-20大孔吸附树脂对EGCg具有较好的吸附与解吸效果，其静态解吸量达46.47 mg/g，在6种树脂中效果最佳．

表1 不同树脂对EGCg的静态吸附量与静态洗脱率Table 1 The static adsorption capacity and the static desorption percentage of EGCg by different resins

2.2 HP-20树脂的等梯度洗脱条件优化

HP-20对EGCg的等梯度洗脱正交试验结果如表2所示．结果表明，以EGCg的得率和纯度作为考察指标，对EGCg洗脱得率影响的显著程度大小依次为乙醇体积分数、上样量、洗脱流速、洗脱体积，并以1.8 g上样量、2 BV/h流速、40%乙醇、洗脱体积2 BV为最佳组合，在此工艺条件下，EGCg的得率与纯度分别为95.22 %和55.92 %．

表2 正交试验中EGCg得率与纯度的极差分析Table 2 The poor analysis of EGCg yield rate and purity in orthogonal experiment

2.3 HP-20树脂的连续梯度洗脱条件优化

2.3.1 乙醇体积分数的筛选

结果（表3）表明，采用30%乙醇洗脱并收集1～5号样，几乎可以把EGCg完全洗脱下来，其中3号样的纯度和得率最高，可达68.28%和45.71%．同时，EGCg主要集中在0.6～2.5 BV段（图1），其后的洗脱液中 EGCg纯度及得率均较低，因此收集30%乙醇洗脱液中的0.6～2.5 BV体积段，可得到较高纯度及含量的EGCg．

表3 不同体积分数乙醇洗脱EGCg得率和纯度Table 3 Effect of different ethanol concentration on the yield rate and purity of EGCg

图1 30%乙醇梯度洗脱EGCg纯度及得率Fig.1 The curve of EGCg’s yield rate and purity in gradient elution by 30% ethanol

2.3.2 EGCg得率、纯度综合效果较好收集段筛选

表4结果表明，在30%乙醇，125 mL树脂上样1.8 g，2 BV/h流速的条件下，收集的第3个样液,，EGCg纯度最高，可达71.55%，得率为28.14%．第2个收集样液的EGCg纯度与得率分别为65.09 %和43.94%，因此合并两个收集段的样液，EGCg的纯度与得率分别为68.32%和72.08%．将所得合并液浓缩、结晶，可得到相应的EGCg高纯品，符合工业化高效生产高纯EGCg的技术要求．

表4 30%乙醇洗脱分步收集EGCg的得率与纯度Table 4 The extraction yield and purity of EGCg collected step by step by 30% ethanol

3 结 论

HP-20大孔树脂具有较好的分离纯化 EGCg的性能，其最优工艺技术参数为：柱体积为125 mL分离纯化EGCg时，上样量1.8 g、30%乙醇、流速2 BV/h、洗脱体积2 BV，收集1～2 BV体积段的洗脱液，EGCg的纯度和得率分别达 68.32%和72.08%，具有较好的工业化应用价值．

[1] 宛晓春，王泽农，汪琢成，等．茶叶生物化学[M]．北京：中国农业出版社，2003．

[2] 梅全喜，毕焕新．现代中药药理手册[K]．北京：中国中医药出版社，1998．

[3] Sakata R，Ueno T，Nakamttra T，et a1．Green tea polyphenol epigal catechin-3-gallate inhibits platelet derived growth factor induced proliferation of human hepatic stellate cell line LI90[J]．J Hepatol， 2004，40（1）：52-59．

[4] Frei B，Higdon J．Antioxidant activity of tea polyphenols invivo：Evidence from animal studies[J]．J Nutr，2003，133：3275-3284．

[5] 方芳，崔志清，韩永晶．茶儿茶素的药效研究概况[J]．中草药，2000，16（6）：124-125．

[6] 汪茂田，谢培山，王忠东，等．天然有机化合物提取分离与结构鉴定[M]． 北京：化学工业出版社， 2002．

[7] 陶容达．茶多酚的制备和应用进展[J]．化学世界，1994，12（2）：64-67．

[8] 于海宁，沈生荣，臧荣春，等．茶多酚中儿茶素类的HPLC分析方法学考察[J]．茶叶科学， 2001， 21（1）：61-66．

[9] Zhong S A，Zhou C S，Yang J Y．Separation and preparation of ester catechins by high performance liquid chromatography[J]．Chem World，2003，34（5）：237-240．

[10] 杜琪珍，李名君，陈启坤．高速逆流色谱法分离茶叶中的儿茶素[J]．色谱，1996，14（4）：20-21．

[11] 葛宜掌，金红．茶多酚的离子沉淀提取法[J]．应用化学，1995，12 （2）：107-109．

[12] 董文宾，胡英，周玲．有机溶剂法制备茶多酚的工艺研究[J]．食品工业科技，2002，9（23）：44-47．

[13] 王霞，高丽娟，林炳昌．表没食子儿茶素没食子酸酯EGCg的分离与制备[J]．食品科学，2005，26（9）： 242-245．

[14] 张盛，刘仲华，黄建安，等．吸附树脂法制备高纯儿茶素的研究[J]．茶叶科学，2002，22（2 ）：125-130．

[15] 龚雨顺，刘仲华，黄建安，等．大孔吸附树脂分离茶儿茶素和咖啡因的研究[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2005，31（1）：50-51．

[16] GB/T8305─87 茶水浸出物测定[S]．

英文编辑：胡东平