PIK3CA蛋白在大肠癌变过程中的表达及临床意义

李扬扬 吴淑华 刘鲁英 牟清海 赵大华

1滨州医学院病理学教研室 滨州市 256603;2滨州医学院附属医院病理科

PIK3CA蛋白在大肠癌变过程中的表达及临床意义

李扬扬1吴淑华1刘鲁英1牟清海2赵大华2

1滨州医学院病理学教研室 滨州市 256603;2滨州医学院附属医院病理科

目的 研究PIK3CA蛋白在大肠癌变过程中的表达差异及临床病理的相关性,探讨其临床意义。方法 应用免疫组化方法检测PIK 3CA蛋白在 79例大肠癌、36例轻度异型增生腺瘤、32例重度异型增生腺瘤、12例正常大肠组织中的表达情况。结果 ①PIK3CA蛋白在大肠癌组织中的表达明显高于正常组织及轻度异型增生大肠腺瘤(P＜0.01),与重度异型增生腺瘤间无明显差异(P＞0.05)。重度异型增生腺瘤组织中PIK 3CA蛋白的表达比轻度异型增生腺瘤及正常黏膜组织中的表达显著增高(P＜0.01);②大肠癌组织中PIK 3CA蛋白的表达与肿瘤的分化程度、临床分期及淋巴结转移等因素具有相关性(P＜0.05),而与患者的性别、年龄、部位、肿瘤的大小及组织学类型等因素无关(P＞0.05)。结论 PIK 3CA在大肠癌的发生发展过程中具有重要作用,检测PIK3CA对于大肠癌的早期诊断、判断预后有重要意义。

PIK 3CA蛋白;大肠癌变;免疫组化;癌基因

大肠癌是我国常见的消化系统肿瘤,其发病率仅次于胃癌和食管癌,居第三位。近年来,由于生活环境和饮食习惯的改变,其发病率逐年上升,并且有年轻化的趋势,严重威胁人们的生命,影响患者的生活质量。深入研究大肠癌的发生机制对于大肠癌的防治具有重要的临床意义。PIK3CA是近年来新发现的一种癌基因,编码 PI3Ks的 p110催化亚单位,即 PI3Kp110a[1]。PI3Ks能磷酸化 PIP2产生体内重要的第二信使 PIP3,因此推断 PIK3CA可以通过作用于 PI3K/AKT信号通路参与体内细胞的增殖等重要生理功能的调节。研究发现人类 30%的恶性肿瘤存在 PIK3CA的突变。本实验将通过免疫组织化学的方法检测 PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)在正常大肠黏膜组织、大肠腺瘤组织及大肠癌组织的表达情况,探索 PIK3CA突变在大肠癌癌变过程中的作用,为大肠癌的早期发现、早期治疗及判断预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集滨州医学院附属医院 2006年9月—2009年 3月的手术或肠镜切除的大肠病变标本共 159例。其中大肠癌 79例,男 35例,女 44例,均为首次发现,术前未行任何治疗;年龄 29～88岁,平均年龄 60岁。肿瘤大小:直径≥5 cm者 50例,＜5 cm者 29例;组织学类型:管状腺癌 65例,粘液腺癌 14例;分化程度:高分化 48例,中、低分化 31例;淋巴结转移 48例,无转移 31例。按国际癌症防治联合会(UICC)2002年 TNM分期标准,Ⅰ期和Ⅱ期共 12例,Ⅲ期和Ⅳ期共 67例。根据 WHO大肠腺瘤分级标准(2005年)[2],将大肠腺瘤分为轻、中及重度异型增生腺瘤三类,本实验选取轻度异型增生腺瘤(36例)和重度异性增生腺瘤(32例),设 12例病变旁的正常大肠黏膜组织为对照组。所有标本均经 10%福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋。

1.2 试剂 兔抗人 PI3Kinase p110alpha抗体浓缩液购自 Cell Signaling Technology公司,Max VisionTM快速免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 严格按照Max VisionTM快速免疫组化方法步骤操作:将石蜡包埋组织制成 3μm切片,脱蜡至水。3%H2O2去除内源性过氧化物酶,置于 EDTA修复液中(pH=9.0),高压锅加热 10 min进行抗原修复。按 1∶100比例稀释一抗,加一抗后 4℃过夜,PBS冲洗后滴加二抗,DAB显色,脱水透明,中性树胶封片。用已知阳性表达的脑组织做阳性对照,PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判断与量化 以出现棕黄色颗粒为阳性标志,PI3Kp110a阳性表达在上皮细胞胞浆内。置每例免疫组化切片于高倍镜下(×400),随机选取 5个不同视野,使用 IPP病理图像分析软件对图像进行分析,测定每个视野下 PIK3CA蛋白阳性表达的平均光密度,以每张切片 5个视野平均光密度的平均值作为该例组织的测量值,平均光密度值越高其蛋白表达水平越高。

1.5 统计学分析 全部数据均采用 SPSS15.0统计软件进行处理,各组光密度值以±s表示。不同病变各组均数比较用方差分析,不同病变各组两两比较用 Bonferroni法;PIK3CA蛋白表达与大肠癌临床病理等因素的关系用多重线性回归分析。

2 结果

2.1 大肠不同病变组织中 PIK3CA蛋白的表达PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)阳性表达部位主要位于上皮细胞的胞浆内(见图 1～4)。在大肠癌组织中,PI3Kp110a的表达水平显著高于正常大肠黏膜组织及轻度异型增生腺瘤(P＜0.01),而与重度异性增生腺瘤中的蛋白表达相比差异不明显,无统计学意义(P＞0.05);PI3Kp110a在大肠重度异性增生腺瘤组织中的表达与轻度异型增生腺瘤和正常大肠黏膜组织中的表达相比有显著差异(P＜0.01);大肠轻度异型增生腺瘤与正常大肠黏膜组织之间的表达相比无显著差异(P＞0.05)(见表 1)。

图1 大肠腺瘤(轻度异型增生)PI3Kp 110a的表达(×100)

图2 大肠腺瘤(重度异型增生)PI3Kp110a的表达(×100)

图3 大肠癌组织中PI3Kp 110a的表达(×100)

图4 大肠癌组织中PI3Kp110a的表达(×200)

表1 大肠不同病变组织PIK 3CA蛋白的表达

2.2 大肠癌组织 PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)的表达与临床病理因素的关系 在大肠中低分化腺癌组织中 PI3Kp110a的表达高于高分化腺癌,具有显著性差异(P＜0.05);伴有淋巴结转移的大肠癌组织中PI3Kp110a的表达明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05);PI3Kp110a的表达与肿瘤的 TNM分期有关,Ⅲ ～Ⅳ期明显高于Ⅰ ～Ⅱ期(P＜0.05);而 PIK3CA蛋白的表达与大肠癌患者的年龄、性别,肿瘤的大小、部位、类型等均无相关性(P＞0.05)(见表 2)。

3 讨论

PIK3CA是 Volinia等于 1994年发现的一种癌基因,定位于三号染色体 3q26.3,全长 34 kb。PIK3CA基因在人体正常的脑、肺、乳腺、食管等多个组织均有表达,可能参与体内细胞重要的生理功能,然而在癌组织中 PIK3CA基因发生突变并可以过度表达。随着人们对 PIK3CA蛋白(PI3Kp110 a)在肿瘤发生中作用的认识,而倍受关注。研究发现,PIK3CA是一种体细胞突变癌基因,在乳腺癌、宫颈癌、肺癌等人类多种恶性肿瘤都发现有 PIK 3CA的突变[3～5]。PIK3CA编码 I类磷脂酰肌醇 3激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinases,PI3Ks)的 p110催化亚单位,即 PI3Kp110a,其蛋白主要表达在细胞浆[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一类脂激酶家族,其能特异性的磷酸化磷脂酰肌醇的 3位羟基,产生体内的第二信使肌醇脂类物质[6]。其中ⅠA型PI3Ks是由 p110催化亚单位和 p85调节亚单位组成的二聚体蛋白,其通过 p85的“SH2结构域”被上游的 RTK(受体酪氨酸激酶)激活[7],活化的 PI3Ks能够磷酸化 PIP2生成体内重要的第二信使 PIP3,PIP3可通过下游多种分子调控细胞的生长、代谢和迁移等重要的生理功能[8,9]。Catasus等[10]研究发现,PIK3CA的突变,可以导致其蛋白产物PI3Kp110a的表达增加,进而可以上调 PI3Ks的活性,PI3Ks活性的增强可以通过 PI3K/AKT信号通路影响下游分子引起细胞代谢、细胞周期等的失调和紊乱,从而导致细胞的癌变。

近年来随着大肠癌发病率的增高,深入研究大肠癌的发生发展机制,做到早预见、早发现、早诊断、早治疗成为大肠癌防治的重点。肿瘤的发生机制十分复杂,目前研究发现,经腺瘤癌变是大肠癌发生的重要途径之一,绝大多数的大肠癌来源于原先存在的腺瘤,即所谓的腺瘤腺癌顺序[11]。Morson等[12]认为大肠由腺瘤演变为腺癌的过程约 10年左右,而重度不典型增生的腺瘤演变为早期癌大约为 3～6年的时间。分子生物学的研究表明,除少数遗传性肿瘤外,在大肠癌发生发展的不同阶段,可出现多种基因的改变,包括癌基因的突变及过度表达、抑癌基因的缺失或失活,众多基因改变的相互作用导致大肠癌的发生。Yardena等[13]对癌基因 PIK3CA的研究提出 PIK 3CA的突变可能导致大肠腺瘤癌变,但PIK3CA蛋白(PI3Kp110a)在经腺瘤癌变过程中的表达与 PIK 3CA突变是否一致尚不清楚。本实验采用免疫组织化学方法,检测 PI3Kp110a在大肠癌变过程中由正常黏膜组织-上皮增生-腺瘤-癌变等多个步骤演进过程中的表达情况,旨在探讨 PIK 3CA在大肠癌变演进过程中所发挥的作用。

本实验研究结果显示,PI3Kp110a的表达在大肠癌组织中明显增高,可见在大肠癌中存在PIK3CA基因的突变。在从正常大肠组织、轻度异型增生腺瘤、重度异型增生腺瘤到腺癌的演变过程中,PI3Kp110a在大肠癌组织中其表达明显高于大肠其他病变阶段组织,与轻度异型增生腺瘤组织及正常大肠组织相比差异具有显著性(P＜0.01),表明PIK3CA的突变在大肠癌发生中具有重要作用,其突变可能推动正常大肠黏腹组织和大肠腺瘤组织的癌变。本实验显示,在大肠重度异型增生腺瘤组织中,PI3Kp110a也呈高表达,明显高于正常大肠黏膜组织及大肠轻度异型增生腺瘤组织,差异具有显著性(P＜0.01),而与大肠癌组织无明显差异,推测PIK3CA的突变发生在正常组织-轻度异型增生腺瘤-重度异型增生腺瘤-大肠癌演变过程的后期阶段,主要在大肠重度异型增生腺瘤到大肠癌的演进过程中发挥作用,可能与细胞获得侵袭性转变为癌细胞的过程有关,这点与 Yardena等[13]对于癌基因PIK3CA的研究结果相吻合。

本实验资料显示大肠癌好发于中老年人,其发病率占 86.1%,但在大肠癌中 PI3Kp110a的表达与临床病理因素相关性的研究中发现,PI3Kp110a的表达与大肠癌患者的年龄并无明显相关性,其表达与患者的性别、肿瘤的大小以及组织学类型等因素亦无相关。但是,本研究发现 PI3Kp110a的表达与大肠癌的分化程度具有相关性,其表达在高分化腺癌与中、低分化腺癌相比差异具有显著性,肿瘤分化程度越低其蛋白表达水平越高;而关于 PI3Kp110a的表达与淋巴结转移的相关性分析结果显示,伴有淋巴结转移的大肠癌组织中的表达明显高于未发现淋巴结转移者,两者相比有显著性差异;另外,PI3Kp110a的表达与大肠癌的侵犯深度及肠外转移即肿瘤的 TNM分期具有明显相关性,Ⅲ ～Ⅳ期显著高于Ⅰ ～Ⅱ期。我们认为,拥有癌基因 PIK3CA突变的细胞分化能力低,具备较强的侵袭能力,易出现早期转移。因此,检测 PI3Kp110a反应癌基因PIK3CA的突变,可成为预测肿瘤的分化,判断大肠癌预后的一个重要指标。

总之,癌基因 PIK3CA突变在大肠癌的发生发展过程中发挥了重要的作用,其突变可能是导致大肠癌变的重要因素之一,进一步认识癌基因 PIK3CA突变作用对于揭示大肠癌发生发展的分子机制具有重要的意义。癌基因 PIK3CA编码的蛋白PI3Kp110a在大肠癌变不同阶段的表达差异提示检测 PI3Kp110a可成为临床观测肿瘤的进展程度、判断预后的重要指标,也为临床早期警示大肠癌变提供了重要的理论依据。人类恶性肿瘤的发生与多种因素有关,具有复杂的分子基础,是多步骤、多基因改变的复杂过程。癌基因 PIK3CA的发现为我们研究肿瘤的发生发展提供了新的方向,癌基因PIK3CA突变及其蛋白的表达在肿瘤发生发展中的作用及机制还有待于进一步的研究。

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Expression and clinical significance of PIK 3CA in the progress of colorectal canceration

LI Yangyang1WU Shuhua1LIU Luying1MU Qinghai2ZHAO Dahua2
1 Department of Pathology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2Department of Pathology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of PIK 3CA in colorectal carcinoma tissue,and also in different tissues in the progression of colorectal canceration.MethodsDetected the PIK3CA expression in 79 cases of colorectal cancer,36 cases of mild dysplasia adenoma,32 cases of severe dysp lasia adenoma,12 cases of normal colorectal organizations by Max Vision TM immunohistochemical technique(IHC).Resu lts①PIK 3CA p rotein exp ression in colorectal cancer was significantly higher than the normal colon tissues and mild dysplasia colorectal adenoma(P＜0.01),then there was no significant difference bet ween colorectal carcinoma and severe dysp lasia adenoma(P＞0.05);PIK3CA protein expression in severe dysplasia adenoma was significantly higher than mild dysp lasia colorectal adenoma and the normal colon tissues(P＜0.01)②PIK 3CA expression was correlated with the degree of tumor differentiation,TNM stage and lymph nodemetastasis(P＜0.05),but its expression was no relation with patients sex,age,position,tumor size and type,(P＞0.05).ConclusionPIK 3CA may play an important role in progression of colorectal canceration,detect PIK 3CA protein exp ression is significant to diagnose and predict patients prognis is.

PIK3CA protein,colorectal carcinoma,IHC,oncogene

R734.2

A

1001-9510(2010)01-0005-04

2009-11-11)