生物柴油生产技术的研究进展

生物柴油是指动植物油脂、餐饮废油等与低碳醇反应所得的脂肪酸甲酯(或乙酯)。近年来，由于石油价格持续飚升和生物柴油的环境友好性，生物柴油的价值日益凸显。制备生物柴油的方法可以归为四类：物理法、化学法、生物酶法以及超临界法。作者在此简要概述了国内外生物柴油生产技术的优缺点及其研究进展。

1 物理法

物理法是指通过物理机械的作用，将动植物油脂与石化柴油按比例混合，得到的油品因掺入了一定的动植物油脂而被称为生物柴油。根据混合方式的不同，物理法分为直接使用法、稀释混合法和微乳化法三种。

1.1 直接使用法

直接使用法迄今已有100多年的历史，柴油机的发明者Rudolph Diesel当初就是用花生油为燃料做测试的[1]。1981年，Bartholomew提出了用食物作燃料的概念，并且指出植物油和酒精必将取代石油，可再生能源一定会取代不可再生能源。植物油具有来源广泛、可再生、对环境友好、运输安全、热值高等诸多优点[2]，但用作燃料时存在粘度高、挥发性低以及不饱和脂肪酸的反应活性差等缺点，特别是植物油的高粘度限制其不能在发动机中长期使用，因此，要改善植物油的性能，必须降低植物油的粘度，可以通过与碳氢化合物稀释混合、微乳化作用、高温分解(热裂解)和转酯反应等[3]几种途径来实现。

1.2 稀释混合法

1983年，Adams等[4]将脱胶大豆油和2#柴油以1∶1及1∶2混合，测试发现,1∶1的混合油出现润滑油层增厚和潜在的凝胶化作用，而1∶2的混合油适合用作农业机械设备的燃料。1986年，Ziejewski等[5]将25%的葵花油和75%柴油混合作为燃料，这种混合油的粘度在40℃为4.88 cSt，高于美国材料试验学会(ASTM)规定的最高粘度值(4.0 cSt)，故将这种混合油直接注入发动机只能作为短期燃料，而不能长期使用。总之，由于植物油的高粘度及其酸性成分、游离脂肪酸成分，直接使用植物油或者与石化柴油混合使用，效果都不能令人满意。

1.3 微乳化法

微乳化法是用甲醇、乙醇、丁醇等表面活性剂和助表面活性剂对植物油进行微乳化，以降低植物油的高粘度。1984年，Ziejewski等[6]用53%碱提取的冬季葵花油、13.3% 的190-Proof乙醇以及33.4%的正丁醇制备了非离子乳化液。其粘度在40℃为6.31 cSt，十六烷值为25，灰分含量低于0.01%。这种乳化液通过200 h的测试，无重大危害出现，但出现厚重积碳、燃烧不完全等现象。2000年，巴西学者de Castro Dantas等[7]提出了一种新的微乳化体系，该体系由柴油、植物油、水、表面活性剂和助表面活性剂五种成分构成，他指出表面活性剂和助表面活性剂的性质以及二者的比值、植物油的成分都会影响乳化效果。

2 化学法

化学法包括高温裂解法和酸/碱催化法。高温裂解法是在无空气或无氧的环境下，通过加热或催化剂辅助加热使一种底物分子分解为另外几种较小的分子。酸/碱催化法是采用酸(如硫酸、盐酸、磺酸)、碱(如氢氧化钠、甲醇钠、氢氧化钾、甲醇钾)等化学催化剂催化三酰甘油与低碳醇反应生成低碳醇的脂肪酸酯(生物柴油主要成分)的过程。

2.1 高温裂解法

高温裂解法生产生物柴油的原料广泛，可以是植物油、动物脂肪、天然脂肪酸等，但反应产物成分很复杂，包括烷烃、烯烃、二烯烃、芳香烃以及羧酸等。Knothe 等[8]将大豆油进行高温裂解，馏分由烷烃、烯烃、羧酸组成，其十六烷值为43，超过大豆油的十六烷值(37.9)和ASTM规定的最低值40。这种馏分在38℃的粘度为10.2 cSt，虽然高于2#柴油的粘度值(1.9～4.1 cSt)，但是远远低于大豆油的初始粘度值(32.6 cSt)。用Na2CO3作催化剂、在450℃下高温裂解油炸过程废弃的棉籽油，产物的主要成分是C8～C20的烷烃(70%)，其次是烯烃和芳香烃。近年来一些研究者用植物油皂作为反应底物进行高温裂解，其产物富含碳氢化合物。Demirbas[9]研究发现，葵花油、玉米油、棉籽油、大豆油在337℃裂解的最大脱羧率分别为96.8%、97.1%、97.5%、97.8%。

2.2 酸催化法

总体说来，酸催化法需要在较高的醇油比、较低的温度与压力以及高浓度的催化剂条件下进行，以期获得较高的产物得率。在酸催化过程中，往往通过提高醇油比来提高脂肪酸甲酯的量，但是两者提高的幅度并不成比例。2006年， Lotero等[10]用硫酸催化大豆油的醇解，当甲醇与油的比例为3.3∶1时，甲酯得率为77%；当甲醇与油的比例提高到6∶1时，甲酯得率达到87.8%；继续提高醇油比到30∶1，甲酯得率才提高到98.4%。尽管酸催化反应可以在较低的温度和压力下进行，但是游离脂肪酸对催化反应的抑制效应以及非常慢的反应速率，使得酸催化法已不被采用[11]。

2.3 碱催化法

当使用高质量的植物油反应时，碱催化剂显示出很高的催化能力，但由于反应产生的植物油皂抑制了脂肪酸甲酯和甘油的分离[12],导致大量的游离脂肪酸不能转化为生物柴油而被转化为植物油皂。此外，反应最好在无水的环境下进行(至少水分含量不要太高)，因为水会使反应向皂化方向转换，生成油皂而降低甲酯的得率。尽管碱催化法对原料的要求较高，但仍然是目前生产生物柴油的主要方法之一。

一般情况下，用过量的KOH或NaOH作催化剂，在60～70℃需要数小时才能反应充分。目前，仍有众多研究者致力于碱法制备生物柴油的探索。2006年，Meher等[13]用1% KOH作催化剂，甲醇与油的比例为6∶1，在65℃、360 r·min-1混合反应3 h，脂肪酸甲酯的产率达到97%～98%。2008年，Rashid等[14]用菜籽油和甲醇为原料，研究了甲醇与菜籽油的比例[(3～21)∶1]、催化剂用量(0.25%～1.5%)、反应温度(35～65℃)、混合强度(160～800 r·min-1)和催化剂类型对反应的影响，发现甲醇与菜籽油比例为6∶1、催化剂KOH的用量为1%、混合强度为600 r·min-1、反应温度为65℃时，催化效率最高，生物柴油的产率达到95%～96%，甲醇或KOH的用量过高或过低都不能转化完全。与KOH和NaOH相比，钠和钾的醇盐(如CH3ONa)具有更高的催化能力，用量为0.5%时，在30 min内即能达到98%的产率。虽然KOH 和NaOH的催化活性稍低，但价格便宜，更适用于实际生产[15]。

碱催化法制备生物柴油的优点在于，不仅甲醇可以重新利用，而且可以副产在医药等领域具有重要价值的甘油。不过甘油需要及时分离，以免产生对人体有害的甲醛和乙醛。碱催化法同时存在一些缺点，如排放大量pH值高、低氮含量的废水，抑制微生物的生长而不被降解，破坏环境。有研究者致力于这种废水的处理研究。韩国学者Suehara等[16]从生物柴油生产工厂分离出了一株可降解油脂的胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)用于生物柴油废水的处理。为了使微生物得以在废水中生长，不仅调节废水的pH值至6.8，还添加了多种氮源(包括硫酸铵、氯化铵和尿素)、酵母提取物、磷酸二氢钾和七水合硫酸镁，得出了酵母提取物浓度为1 g·L-1、碳氮比在17～68之间的优化工艺，这种方法适合小规模生物柴油工厂的废水处理。

3 生物酶法

生物酶法是利用脂肪酶的酯化和转酯反应活性，催化油脂和醇反应生成生物柴油。与物理法和化学法相比，用脂肪酶作催化剂制备生物柴油，具有原料选择性较低、反应条件温和、醇用量少、后处理简单、无污染物排放、副产物甘油较易分离等优点。目前，天然的脂肪酶作为催化剂来生产生物柴油存在着一定的局限性,主要有:(1) 脂肪酶对低链醇的转化率较低,致使脂肪酶用量过大、反应周期过长，脂肪酶的转酯反应活性有待进一步提高；(2)短链醇特别是甲醇对脂肪酶有一定的毒性,酶的使用寿命缩短，生产成本过高，脂肪酶的甲醇耐受性也必须进一步改善。正是这些因素制约着酶法生产生物柴油的大规模应用。

3.1 游离脂肪酶法

游离脂肪酶在反应体系中分散不均、容易结块，且稳定性差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下容易变性失活，使得酯化反应速率慢。酶与底物反应结束后，即使酶仍旧具有较高活力，但回收利用困难。因此游离脂肪酶法已很少使用。

3.2 固定化脂肪酶法

与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶具有酶活力高、稳定性好、可重复利用等优点。

Yi等[17]用氨基酸修饰的壳聚糖珠固定皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶。未修饰的壳聚糖珠固定脂肪酶的固载率达到92.7%，但脂肪酶活力仅为10.4%；氨基酸修饰壳聚糖珠固定化脂肪酶的固载率仅为15%～50%，但脂肪酶活力却高许多，丙氨酸修饰壳聚糖珠固定化脂肪酶活力达49%，亮氨酸修饰壳聚糖珠固定化脂肪酶活力达到51%。Li等[18]通过脒基化反应将皱褶假丝酵母脂肪酶共价结合到聚丙烯腈纳米纤维上制成固定化脂肪酶。30℃保存20 d后，固定化脂肪酶仍保留大于95%的活力，而同等条件下游离脂肪酶丧失了80%的活力，连续使用10次后固定化脂肪酶仍然保留70%的活性。Pahujani等[19]用共价结合的方法将来自芽孢杆菌(BacilluscoagulansBTS-3)的胞外碱性脂肪酶固定在戊二醛激活的Nylon-6上，其蛋白固载量达到228 μg·g-1，固定化脂肪酶在pH值7.5～9.5内保持稳定，55℃下保存2 h后仍保留88%的活性，连续使用8次后残留酶活为初始酶活的85%。

由于固定化方法和固定化材料的不同，固定化脂肪酶的性能，包括酶活力、稳定性、特异性等存在较大的差异。近年来较好的脂肪酶固定化方法还有：采用超滤和交联法将脂肪酶固定于聚砜膜表面，将脂肪酶固定于PVA纳米纤维膜、化学修饰的双峰陶瓷泡沫塑料、甲基修饰的硅胶、壳聚糖纳米纤维膜、纤维素材料等。此外，因为必须对脂肪酶进行一定的分离提纯才能获得较高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生产成本依然较高，限制了其在实际生产中的应用。固定化脂肪酶生产生物柴油今后的研究重点，仍然在于寻找更好的固定化材料和固定化方法，进一步改善固定化酶的相对活力、热稳定性、低碳醇耐受性和催化底物适用范围等性能。

3.3 全细胞固定法

全细胞固定化法是将产脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，从而制备全细胞催化剂，这种方法比固定化酶更为简便、经济，而且固定化过程可在批量化发酵时同步完成。根据全细胞催化剂的发展历程和固定方法的差异，主要分为真菌全细胞催化剂、酵母全细胞催化剂、大肠杆菌全细胞催化剂三种。

3.3.1 真菌全细胞生物催化剂

将产脂肪酶的真菌菌丝体固定到载体支持物上，获得的真菌全细胞催化剂即可用于生物柴油的生产。2001年，Ban等[20]首次将米根霉(Rhizopusoryzae)的菌丝体固定到用聚氨酯泡沫制备的生物支架颗粒(BSP)上获得真菌全细胞催化剂，并研究了预处理方法和水分含量对甲醇解作用的影响。他们还发现向培养基中添加橄榄油和油酸复合物可显著提高全细胞催化剂的脂肪酶活力。早期研究者大多用米根霉作全细胞催化剂，直到今天在实际中得到应用的也仍然只有米根霉。Zeng等[21]用如下培养基来培养米根霉：3%油，7%Pectone,0.12% NaNO3,0.12% KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O，35℃培养40 h后，100 mL基础培养基可产生1×106个孢子。过滤收集细胞，用水冲洗，-70℃真空干燥12 h，直接用作催化剂，研究发现当富集细胞和催化生产生物柴油用同一种油时可获得最大的产量。Ban等[22]在培养基中加入橄榄油和油酸作为添加剂，当存在15%水时甲醇解作用增强至90%。他们又添加0.1%戊二醛增强生物支架颗粒的稳定性，经过6次循环，每次72 h不连续培养，甲醇解率为70%～80%。Hama等[23]利用固定在填充床反应器(PBR)和搅拌槽反应器(STR)中生物支架颗粒上的米根霉全细胞催化剂催化植物油生产生物柴油，发现固定在PBR中生物支架颗粒上的细胞更为稳定。

2008年，Hama等[24]首次采用重组真菌作全细胞催化剂生产生物柴油。他们将异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)的脂肪酶基因转化到米根霉进行异源表达，用多孔生物量支架颗粒固定重组米根霉细胞，用于催化甲醇解反应。研究发现，当向反应体系中添加5%水时，不但可以有效阻止甲醇对脂肪酶的失活效应，而且还使部分甘油酯的酰基转移更加容易，使用10次后甲酯的产率仍可达94%。表明异孢镰刀菌脂肪酶的重组米根霉全细胞催化剂与野生米根霉全细胞催化剂相比，拥有更高的甲酯得率并且脂肪酶更加稳定。

3.3.2 酵母全细胞生物催化剂

3.3.2.1 胞内表达脂肪酶全细胞酵母催化剂

2001年，Matsumoto等[25]开发出了一种酵母工程菌全细胞催化剂制备生物柴油的技术。他们在啤酒酵母MT8-1内超量表达米根霉脂肪酶，并作为全细胞生物催化剂催化制备生物柴油，在无溶剂含水体系中，于37℃反应165 h，反应混合物中脂肪酸甲酯含量为71%。

3.3.2.2 展示表达脂肪酶全细胞酵母催化剂

很多研究者选择构建展示表达脂肪酶的酵母工程菌作为全细胞催化剂。现今发现的酵母表面展示表达系统，大都建立在一种编码凝集素细胞壁蛋白的FLO1基因的基础之上。FLO1蛋白由多个功能域组成，包括分泌信号肽、絮凝功能域、GPI锚定结合信号、细胞膜锚定结合域。Matsumoto等[25，26]在2002年构建了一种表达米根霉脂肪酶的酵母细胞表面展示表达系统，利用了FLO1基因中编码絮凝功能域的FS和FL基因，目标基因的5′端连接到FS或FL基因上构成融合基因，在一种诱导型启动子UPR-ICL控制下启动基因表达，目标蛋白的N段被融合到FS和FL蛋白形成融合蛋白，利用这种表面带有脂肪酶的酵母细胞就可以催化生产生物柴油。利用这种展示表达了FS-米根霉脂肪酶和FL-米根霉脂肪酶的酵母细胞催化甲酯的合成，通过三步添加甲醇反应72 h后，甲酯积累量分别达到78.6%和73.5%，而相比之下胞内表达米根霉脂肪酶的酵母全细胞催化剂反应165 h的甲酯积累量仅为71%。Jiang等[27]将解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的脂肪酶基因LIPY7和LIPY8与FLO1基因中絮凝功能域的编码序列融合在一起，在毕赤酵母(PichiapastorisKM71)中进行表达。共聚焦激光扫描显微镜检测显示脂肪酶成功展示表达在毕赤酵母细胞表面，作者指出这种展示表达了脂肪酶的酵母可作为全细胞催化剂。

3.3.3 大肠杆菌全细胞生物催化剂

Gao等[28]从土壤中分离出一种产脂肪酶的细菌Proteussp.K107，克隆其脂肪酶基因在大肠杆菌BL21中进行表达，将重组大肠杆菌以全细胞催化剂的形式来催化生产生物柴油。研究发现，当用0.3%(质量分数)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理细胞后，其催化活力显著提高，在最适温度15℃反应12 h后生物柴油的产率接近100%。这是大肠杆菌全细胞催化剂第一次用于生物柴油的生产。与其它全细胞催化剂相比，大肠杆菌全细胞催化剂对甲醇有较高的耐受性，为解决生物柴油生产过程中甲醇致使脂肪酶失活这个难题提供了新思路。

4 无催化剂超临界法

超临界法是用处于超临界状态的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等与三酰甘油进行转酯反应制备生物柴油。与传统的生物柴油生产方法相比，超临界法具有快速、高效、易连续操作、无需使用催化剂、受水分和游离脂肪酸的影响小等优点。因此超临界法对于未来大规模生物燃料的生产，特别是从废弃油脂中生产生物柴油，拥有光明的前景。但是超临界法对环境的苛刻要求(如高温高压)、对原料的需求以及相关成本是限制其广泛应用的主要障碍[29]。

超临界法制备生物柴油，不需要任何催化剂，只要对转酯反应过程的工艺参数进行优化，一般就可达到近似100%的转化率。Demirbas[30]研究发现，温度对脂肪酸甲酯的产率具有积极的影响，503 K处理约6 min就达到接近100%的转化率，这是传统方法难以达到的。Warabi等[31]研究发现，短链醇比长链醇具有更高的转化效率。用甲醇处理12 min，甲酯得率接近100%，然而乙醇和丙醇需要45 min才能达到100%的酯化率，丁醇和辛醇的酯化率分别为85%和62%。

5 结语

生物柴油是一种清洁、优质的可再生性能源，在世界石油储量持续减少的今天，开发生物柴油具有极其重大的意义。一百多年以来，生物柴油生产技术日趋成熟。从最初的稀释混合法等到后来的酸碱催化法，再到生物酶催化法和超临界法，越来越先进的技术被开发出来，生物柴油得率不断提高，反应时间不断缩短。随着生物柴油生产技术的不断发展，将涌现出更为优良的生产技术和工艺，并大规模应用于实际生产。

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