乌头类中药中药效指标成分的确定及含量测定Δ

刘永刚，刘倩，张宏桂，乔延江#（.北京中医药大学中药学院，北京市 000；.华北煤炭医学院，唐山市 06003）

含乌头碱中药为常用中药，如《中国药典》收载的川乌、附子等[1]，该类中药中生物碱成分既是其活性成分，也是毒性成分。该类中药大都以炮制入药，其质量优劣直接影响疗效和用药安全。然而，由于标准品的缺乏和仪器的限制，即使《中国药典》通过限定乌头碱的最低检测量来控制该类中药的质量，并通过减少使用量的方法来控制其安全，但中毒事件仍屡有发生[2]。基于此，笔者以附子为研究对象，针对《中国药典》对乌头类中药饮片及制剂只设质量控制的安全指标而无药效指标，导致此类有毒中药制剂安全减效的问题进行了研究，在初步确定新乌头次碱为药效指标成分的基础上，提出用乌头碱作为毒性指标成分、新乌头次碱作为药效指标成分，以双指标质量控制方案来确保乌头类中药的安全、有效。由于乌头碱作为毒性指标成分的研究方法比较成熟，本试验着重对如何确定新乌头次碱为药效指标成分和新乌头次碱的含量测定方法进行研究。

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱（HPLC）系统，包括在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；HP Chemstation RVA0.803色谱工作站（美国Agilent公司）。

1.2 试药

乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯；附子购自四川江油，由北京中医药大学谭钰元教授鉴定为真品；新乌头次碱标准品（笔者自制，经HPLC法测定含量＞98%）。

2 方法与结果

2.1 药效指标成分的确定

2.1.1 新乌头次碱的鉴定 通过质谱、紫外、1H-NMR和13C-NMR确定为新乌头次碱，并用HPLC法测定其纯度＞98%。

2.1.2 附子中生物碱的含量测定 用LC-MSn法对附子中生物碱成分进行初步鉴定，并根据其离子强度大小初步判定新乌头次碱在乌头类生物碱中含量最高。

2.1.3 附子入血成分的鉴定 通过给家兔灌服附子后，用LC-MSn法检测入血成分，发现新乌头次碱为入血成分。

“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”项详细内容另文发表。

2.1.4 乌头碱、新乌头碱、次乌头碱和新乌头次碱受热稳定曲线的变化 将4种生物碱在100℃下进行加热，用HPLC分析峰面积的变化。4种生物碱受热稳定曲线的变化见表1。

表1 4种生物碱受热稳定曲线的变化Tab 1 Stability curves of 4 kinds of alkaloids in heated condition

2.2 新乌头次碱的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zobax XDB C1（8250 mm×2.1 mm，5 μm）；检测波长：240 nm；流动相：0.01%氨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（） ；柱温：25 ℃；流速：1 mL·min-1。色谱见图1。

2.2.2 溶液的制备 （1）标准品贮备液：精密称取新乌头次碱标准品2.5 mg，加0.01%盐酸-甲醇制成每1 mL含新乌头碱0.51 mg的溶液，作为标准品贮备液。（2）供试品溶液：取样品粉末（过20目筛）1 g，精密称定，置锥形瓶中，加10%氨水1 mL浸润，再精密加入乙醚25 mL，超声提取30 min，吸取上清液，残渣用乙醚洗涤3次，每次5 mL，合并提取液与洗涤的乙醚液，50℃水浴挥干乙醚，用0.01%盐酸-甲醇10 mL溶解，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液[3]。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取标准品贮备液0.5、1、1.5、2 mL，分别置于10 mL量瓶中，用0.01%盐酸-甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列标准溶液。精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定。以峰面积积分值（X）为横坐标，进样量（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝304.5X－3.53（r＝0.9998）。结果表明，新乌头次碱进样量在0.51～10.2 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，重复进样5次。结果，新乌头次碱峰面积的RSD＝0.51%，表明方法精密度良好。

2.2.5 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，测定。结果，新乌头次碱峰面积的RSD＝1.35%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一附子药材粉末6份，每份1.0 g，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分析测定。结果，新乌头次碱平均含量的RSD＝1.4%，表明方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 取附子样品6份（其新乌头次碱的含量为0.354 mg·g-1），分别精密加入新乌头次碱标准品贮备液适量，按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.8 检测限的测定 按信噪比为3∶1计算，本试验条件下新乌头次碱的检测限按进样量计为1.5 ng。

2.2.9 样品含量测定 取3个批次的样品，分别按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，重复进样3次，取平均值按回归方程计算含量，结果见表3。

表3 不同批次炮制附子中新乌头次碱的含量（n＝3）Tab 3 Content of benzoylmesaconine in different bathes of processedA.carmichaeli（n＝3）

3 讨论

本试验通过化合物的含量测定及是否为入血成分、标准物稳定性性质研究，初步建立了确定乌头类中药中药效指标成分的方法，这为其它中药如何选择标准品提供了方法上的借鉴。

若按照《中国药典》规定的方法操作，乌头类生物碱含量过低、炮制过度甚或乌头类中药伪品或赝品均较容易通过质检并作为药用，这务必会降低成药的疗效。因此，增加新乌头次碱含量控制项是合理、有效的，可用于加强乌头类中药的质量控制。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：132.

[2]陈 幸，夏文娟，方娜娜.对《中国药典》附子中乌头碱限量检查的商榷[J].药物分析杂志，1995，15（4）：6.

[3]刘 芳，于向红，李 飞.HPLC测定附子及其炮制品中3种双酯型生物碱的含量[J].中国中药杂志，2006，31（14）：1160.