HPLC法测定金顶侧耳中延胡索酸的含量

刘佳，朴惠顺，施溯筠，张善玉（长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，延吉市 133000）

金顶侧耳（Pleurotm citrinopileatus Sing.）隶属于侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属，又称金顶蘑、榆黄蘑、榆黄菇、玉皇蘑，是一种富含蛋白质、氨基酸和维生素等多种营养成分的食药用菌[1，2]。现代研究表明，其还含有延胡索酸、D-甘露醇、麦角甾醇、洛伐他汀和多糖等生物活性成分[3，4]。其中，延胡索酸具有抗肿瘤、抗菌、抗电休克、镇痛、镇咳、平喘等活性[2]。目前，对金顶侧耳中延胡索酸含量测定方法的报道较少。因此，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定了金顶侧耳中延胡索酸的含量，以期为金顶侧耳的质量控制提供试验基础。

1 材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外检测器、AT-330柱温箱（日本岛津公司）；N2000色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；KQ2200型数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）。

1.2 试药

延胡索酸标准品（德国Augsburg公司，批号：20071129）；金顶侧耳为吉林省关东大嫂食品有限公司（Ⅰ）、吉林省抚松华冠参茸有限公司（Ⅱ）、集安市新开河有限公司（Ⅲ）、吉林延边参茸工贸有限公司（Ⅳ）和延边丰义土特产有限公司（Ⅴ）产品，由延边大学刘永镇教授鉴定均为金顶侧耳P.citrinopileatus Sing.的干燥子实体；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：大连依利特C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（5∶95，用磷酸调pH 2.5）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：216 nm；柱温：25 ℃。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.延胡索酸标准品；B.供试品Fig 1 HPCLchromatogramsA.standard fumaric acid；B.test sample

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液：精密称取延胡索酸标准品适量，加无水乙醇溶解，制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液：取金顶侧耳子实体，60℃下干燥4 h，粉碎过40目筛，精密称取药粉0.5 g，加60%乙醇20 mL，超声处理30 min，放冷，转移至25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，上清液用0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取标准品溶液（80 µg·mL-1）2、5、10、15、20µL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积积分值。以进样量（X，ng）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝3511.9X－66841（r＝0.9999）。结果表明，延胡索酸进样量在0.6～1.6 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取同一标准品溶液，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积。结果，RSD＝0.88%，表明仪器精密度较好。

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 µL，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h各测定1次峰面积。结果，RSD＝1.75%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，延胡索酸的含量分别为0.44%、0.44%、0.45%、0.44%、0.44%和0.43%，平均含量为0.44%，RSD＝1.53%，表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的同一批样品6份，精密称取0.25 g，分别加入一定量的延胡索酸标准品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，计算样品含量及加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 样品含量测定

取5批样品，经干燥、粉碎后分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液，进样10µL，用峰面积外标法测定含量。结果，样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中延胡索酸含量分别为0.64%、0.47%、0.53%、0.38%、0.44%。

3 讨论

本试验分别以无水乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇作为提取溶剂平行操作。结果发现，60%乙醇和40%乙醇的提取效果相对较高且相差不大，但40%乙醇提取出的水溶性杂质较多，故选用60%乙醇为提取溶剂。

取样品粉末适量，精密称定，分别加入60%乙醇，采用不同时间（15、30、60 min）超声提取样品，考察提取时间。结果表明，提取30 min和60 min的含量基本一致，故采用超声提取30 min。

笔者曾试用乙腈-0.4%磷酸二氢钾溶液（20∶80，用磷酸调pH 2.5）[5]、乙腈-0.4%磷酸二氢钾溶液（10∶90，用磷酸调pH 2.5）、乙腈-0.4%磷酸二氢钾溶液（5∶95，用磷酸调pH 2.5）、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（20∶80，用磷酸调pH 2.5）[6]、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（10∶90，用磷酸调pH 2.5）和甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（5∶95，用磷酸调pH 2.5）6种流动相，结果以甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（5∶95，用磷酸调pH 2.5）为流动相，延胡索酸出峰时间适中（约9.5 min），与周围杂质峰分离较好，且节约了价格较贵的色谱甲醇的用量，降低了成本，故选用该流动相进行试验。

本试验建立的以HPLC法测定金顶侧耳中延胡索酸含量的方法，简便、准确、重复性好。对长白山地区5个不同生产公司的样品进行测定的结果表明，不同金顶侧耳干燥子实体中延胡索酸含量在0.38%～0.64%之间，含量差异较小。因金顶侧耳的产地除长白山地区外，还有黑龙江、辽宁、河北、广东、西藏等地[7]，而此次所测定的金顶侧耳仅为长白山地区采集，因此有必要作进一步研究，以确定更为合理的含量限度范围。

[1]谢福泉，羿 红，兰家细，等.金顶侧耳子实体营养成分分析[J].食用菌学报，2007，14（2）：81.

[2]张 影，包海鹰，李 玉.珍贵食药用菌金顶侧耳研究现状[J].吉林农业大学学报，2003，25（1）：54.

[3]包海鹰，张 影，图力古尔，等.金项侧耳化学成分的研究[J].菌物学报，2004，23（2）：262.

[4]刘贤铭.真菌多糖的抗肿瘤研究及临床应用评价[J].中国药房，2006，17（8）：629.

[5]廖建春.高效液相色谱法测定七叶莲胶囊中延胡索酸的含量[J].药学与临床研究，2007，15（5）：421.

[6]游勇基，程广强.HPLC法测定肿节风中延胡索酸的含量[J].中国中药杂志，1997，22（9）：554.

[7]图力古尔，李 玉.我国侧耳属真菌的种类资源及其生态地理分布[J].中国食用菌，2001，20（5）：8.