洁阴泡腾片质量标准研究Δ

杨志洁，姚仲青，朱虹（1.江苏溧阳市中医院，溧阳市 13300；.南京希元生物医药科技有限公司，南京市 10037）

洁阴泡腾片是本院自制制剂，由白鲜皮、地肤子、蛇床子、苦参、黄柏等9味药组成，具有清热燥湿、杀虫止痒的功效。为保证制剂质量，笔者对泡腾片的质量标准进行了研究。本研究主要采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的白鲜皮、苦参、黄柏、花椒、蛇床子分别进行鉴别；采用高效液相色谱（HPLC）法对黄柏的主要活性成分盐酸小檗碱进行含量测定。结果表明，所建标准具有专属性，其方法重现性好，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

LC-10AT型HPLC仪（日本岛津公司）；SPD-10AVP型紫外-可见检测器（日本岛津公司）。

洁阴泡腾片（溧阳市中医院制剂室，批号：080425、080428、080430）；对照品桐（批号：111700-200501）、苦参碱（批号：805-200005）、盐酸小檗碱（批号：110713-200609）及对照药材黄柏（批号：120937-200305）、花椒（批号：121106-200402）、蛇床子（批号：121030-200405）均为中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 白鲜皮的TLC鉴别[1]取本品药片研细，称取粉末2 g，加三氯甲烷30 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，得供试品溶液；另取桐对照品，加甲醇1 mL溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液，即为桐对照品溶液；再取不含白鲜皮的阴性对照提取物1 g，照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点清晰，置365 nm紫外光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。白鲜皮的TLC见图1。

2.1.2 苦参的TLC鉴别[1，2]取本品药片研细，称取粉末0.5 g，加浓氨试液0.5 mL、三氯甲烷25 mL，超声20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，得供试品溶液；另取苦参碱对照品，加乙醇制成每1 mL含0.2 g的溶液，即得对照品溶液；再取不含苦参的阴性对照提取物0.5 g，照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各4µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5）为展开剂，展开（展距8 cm），取出，晾干，再以苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）在10℃以下放置的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干后再展一次，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同橙色的斑点；阴性对照无干扰。苦参的TLC见图2。

2.1.3 黄柏的TLC鉴别[1，3]取本品药片研细，称取粉末0.5 g，加甲醇25 mL，加热回流30 min，滤过，滤液即为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.5 g，加三氯甲烷15 mL，超声20 min，滤过，得对照药材溶液；另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，得对照品溶液；再取不含黄柏的阴性对照提取物0.5 g，照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。吸取上述4种溶液各1µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）为展开剂，置氨蒸汽预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。黄柏的TLC见图3。

图1 白鲜皮的TLC1～3.供试品；4.阴性对照；5.桐对照品Fig 1 TLC of D.dasyarpus1～3.test samples；4.negtive control；5.fraxinellon control

图2 苦参的TLC1.苦参碱对照品；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 2 TLC of S.flavescens1.matrine control；2～4.test samples；5.negative control

图3 黄柏的TLC1.盐酸小檗碱对照品；2.黄柏对照药材；3～5.供试品；6.阴性对照Fig 3 TLC of P.chinense1.berberine hydrochloride control；2.Corter Phellodendri；3～5.test samples；6.negative control

2.1.4 花椒的TLC鉴别[1，4]取本品药片研细，称取粉末0.5 g，加乙醚10 mL，浸泡过夜，过滤，滤液挥至1 mL，即得供试品溶液；另取花椒对照药材粉末0.5 g，按上述方法制得对照药材溶液；再取不含花椒的阴性对照提取物0.5 g，照供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。花椒的TLC见图4。

2.1.5 蛇床子的TLC鉴别 取本品药片研细，称取粉末1 g，加乙醚15 mL，浸泡10 min，超声5 min，过滤，滤液挥至1 mL，即得供试品溶液；另取蛇床子对照药材粉末0.5 g，加三氯甲烷15 mL，超声20 min，滤过，即得对照药材溶液；再取不含蛇床子的阴性对照提取物1 g，照供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯（30∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。蛇床子的TLC见图5。

图4 花椒的TLC1.花椒对照药材；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 4 TLC of Z.bungeanum1.Pericarpium Zanthoxyli；2～4.test samples；5.negtive control

图5 蛇床子的TLC1～3.供试品；4.阴性对照；5.蛇床子对照药材Fig 5 TLC of C.monnieri1～3.test samples；4.negative control；5.Fructus Cnidii

2.2 定量分析[1，5，6]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：C18柱（150 mm×6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70）；检测波长：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取在100℃干燥5 h的盐酸小檗碱对照品5.2 mg，加甲醇稀释并定容至25 mL，作为对照品贮备液。精密吸取此贮备液5 mL，以甲醇稀释至10 mL，即得对照品溶液（0.104 mg·mL-1）。

2.2.3 供试品溶液、阴性对照溶液的制备 取样品5片，研细，取0.1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；另按处方制得不含黄柏的阴性样品，同法制得不含黄柏的阴性对照溶液。

2.2.4 阴性对照试验 分别精密吸取对照品溶液5µL、阴性对照溶液和供试品溶液各10µL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，计算。色谱见图6。

图6 高效液相色谱图A.盐酸小檗碱对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.盐酸小檗碱Fig 6 HPLC chromatogramsA.berberine hydrochloride control；B.test sample；C.negative control；1.berberine hydrochloride

由图6可知，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上有一相同保留时间的色谱峰，而阴性对照在此时间未显色谱峰，表明在此试验条件下，其它成分对测定无干扰，方法具有专属性。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀；分别精密吸取上述各溶液20µL，注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积。以进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝4046726.442X+192721.8（r＝0.9978）。结果表明，盐酸小檗碱进样量在0.208～1.04µg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液5.0µL，连续进样6次。结果，RSD＝0.56%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取本品0.1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品，于室温放置。分别在0、1、2、4、6、8 h时测定其中盐酸小檗碱含量，色谱条件同“2.2.1”，进样量为20µL。结果，RSD＝0.86%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.8 重现性试验 取“2.2.7”项下样品6份，每份0.1 g，精密称定，制得供试品溶液。精密吸取供试品溶液20µL、对照品溶液5µL，分别注入色谱仪，测定其中盐酸小檗碱含量。结果，平均含量为0.822%，RSD＝0.78%，表明方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的本品（含盐酸小檗碱0.822%）6份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入盐酸小檗碱对照品贮备液2.0 mL（0.208 mg·mL-1），加至50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取对照品溶液5µL和供试品溶液20µL，分别注入液相色谱仪，测定。结果，盐酸小檗碱平均回收率为101.38%，RSD＝1.39%。

2.2.10 样品含量测定 取3批样品，测定其中盐酸小檗碱的含量，结果分别为每片8.29、7.93、8.66 mg。

2.2.11 含量限度制订依据 根据处方，每1000片中含主药黄柏300 g，即每片含黄柏0.3 g。根据2005年版《中国药典》（一部）“黄柏”项下规定，黄柏药材中的小檗碱含量应不低于3.0%，如果100%转移到制剂，应含小檗碱9 mg。而实际制备工艺中，小檗碱的转移率为75%～85%。因此，根据试验，拟定小檗碱的最低转移率为70%，则制剂中的小檗碱含量应不低于每片6.3 mg。3批中试制剂的研究结果表明，制剂中小檗碱的含量符合要求，由此制定制剂中小檗碱的含量应为每片不低于6.3 mg。

3 讨论

本制剂处方中白鲜皮清热燥湿、杀虫止痒，为主药，其主要活性成分为白鲜碱、皮酮。但笔者通过预试验测定结果表明，由于皮酮在制剂中的含量极微，测定非常困难，因此选择了含量相对丰富、测定相对容易的小檗碱进行含量测定；黄柏具清热燥湿、解毒的功效，小檗碱为其主要活性成分，因此选择了小檗碱作为含量测定的依据。文献报道小檗碱的含量测定方法主要有薄层扫描法[6]、HPLC法[1，5]等方法。笔者采用HPLC法对制剂中所含的主要活性成分小檗碱进行了含量测定研究，结果表明方法稳定、回收率高，且具有专属性。

本试验对处方中主要药味的定性鉴别采用了TLC法，TLC条件参考文献及《中国药典》方法，并对所鉴别药味制备了阴性对照。结果，供试品斑点清晰，表明方法可行。

综上所述，本试验所采用的定性、定量方法简便、专属性强，可以作为本制剂的质量控制方法。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录31.

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[6]刘 强，李 立，谭 可.薄层扫描法测定阴道栓中盐酸小檗碱的含量[J].中国药房，2005，16（7）：541.