咬合创伤诱导海马区星形胶质细胞的上调

贾 静 刘洪臣 刘雪梅 章捍东

海马是神经系统的高级核团，边缘系统的重要组成部分，普遍的观点认为海马的功能与记忆、情绪等反应有关[1,2]，而对于海马的其它功能却知之甚少。近年来的一些研究显示海马可能在疼痛的调节中起作用。以往对咬合创伤的研究显示，咬合创伤后能引起初级感觉中枢内SP、NMDAR、PPTA以及胶质细胞的改变[3-5]，但对于海马的结构和功能影响却未见报道。本实验通过建立咬合创伤动物模型，观察大鼠咬合创伤后海马区星形胶质细胞的变化，了解海马结构是否参与了咬合创伤的反应及调节。

1.材料和方法

1.1 实验动物 选用健康雄性SD大鼠35只，体重280-320g，鼠龄10-12w。将其平均分为7组，一组作为对照，其余六组分别为咬合创伤1d、3d、7d、2w、4w、5w组。所有大鼠自由饮水，喂食硬质鼠料，于动物房适应性饲养一周后进行实验。

1.2 咬合创伤动物模型的建立 10%水合氯醛麻醉大鼠，于左侧上颌第一磨牙面粘结方丝，抬高咬合0.5mm,形成左侧磨牙早接触的创伤咬合，待粘结剂彻底干燥后，将动物放回正常饲养。各组动物到达预定时间点后，以100g/L水合氯醛腹腔深度麻醉后开胸，经升主动脉插管，先以生理盐水100ml冲洗血液，继以含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)500ml灌流2h，注毕立即取全脑置于200g/L蔗糖溶液(4℃)浸泡，直至完全沉底。连续冰冻冠状切片，片厚10μm，置于0.01mol/L的PBS中。

1.3 免疫荧光染色 切片在0.1mol/L PBS中漂洗后，入含0.5%Triton X-100的0.1mol/L PBS中浸泡30min(室温)，然后入兔抗GFAP抗体稀释液(1∶100)，4℃冰箱过夜后，0.1mol/L PBS振洗30分钟，入TRITC-IgG室温孵育2小时，0.1mol/L PBS振洗后Moviol封片。激光共聚焦显微镜下观察，采集图像。

1.4 图像采集及分析 激光共聚焦显微镜下采集免疫荧光染色图像，每张切片选取5个视野，计数胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞数。对各实验组与对照组的比较采用方差分析，统计过程采用Stata7.0软件进行。

2.结果

正常大鼠海马区平均GFAP阳性星形胶质细胞数为42.2±6.54，7d组GFAP阳性细胞数量开始增加，2w组GFAP阳性细胞数继续上升，4w组达高峰，主要分布在CA1区及CA3区，但以CA3区为主，5w时阳性细胞数开始下降，与2w组阳性率接近(图1-3,附表)。

附表 咬合创伤后大鼠海马CA3区GFAP阳性细胞数(个/mm2)

3.讨论

海马是边缘系统中的重要结构，与其它脑区有着广泛的纤维联系。是调节学习、记忆、行为、情绪反应的重要神经解剖学基础。同时在应激调控中也起着非常重要的作用。近年来的研究显示，海马可能参与痛感觉反应和痛调控。给予致痛强度热刺激，可引起海马局部血流发生改变；在海马齿状回局部注射利多卡因，可以减轻由热刺激引起的疼痛，而注射IL-2或刺激海马背部可提高痛阈[6]。提示海马参与了伤害性刺激的过程。

海马在痛觉调控中的作用研究较少，集中在海马神经元对疼痛刺激的反应上。动物模型显示，来自不同区域的伤害性刺激可引起海马不同区域的不同变化。Khanna等发现足底注射福尔马林可以诱导海马CA1区c-fos的表达增加[7,8]。同时海马CA3、CA4区PKC免疫阳性细胞增多。而电刺激大鼠牙髓却引起海马CA1区c-fos的表达减少[9]。

胶质细胞在疼痛产生及维持中也发挥了重大作用。在病理性痛刺激作用下,激活的胶质细胞可释放多种神经活性物质,如花生四烯酸、白细胞三烯、前列腺素、一氧化氮、兴奋性氨基酸、神经生长因子等[10]，这些活性物质直接调控着神经元的活动，它们作用于痛觉传递神经元使其处于敏化状态，而活化的胶质细胞可以进一步加强初级传入纤维终末释放SP、EAA和增加产生疼痛物质神经元的兴奋性来调节疼痛[11]，同时通过调控神经活性物质的摄取间接影响神经元的生物活性[12]。本课题组以往的研究显示咬合创伤引起了三叉神经脊束核初级感觉中枢内星形胶质细胞及细胞因子的RNA表达变化[5]，咬合创伤后三叉神经脊束核尾侧亚核内GFAP、IL-1、TNFαmRNA表达上调，且三者呈现一致性相关变化规律，但对于神经系统的高级核团海马是否参与了咬合创伤的口颌面痛反应却未见报道。星形胶质细胞中的胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)，是星形胶质细胞的标志蛋白，可利用GFAP的特异性抗体检测星形胶质细胞。

本实验通过对海马区 GFAP阳性星形胶质细胞免疫染色发现，创伤后7d，海马内GFAP阳性细胞数开始增加，2w组GFAP阳性细胞数继续上升，4w时达到高峰。主要分布在CA1区及CA3区，但以CA3区为主，5w时GFAP阳性细胞数开始下降。但仍保持较高水平。通过实验我们观察到，咬合创伤的刺激引起了海马CA1、CA3区星形胶质细胞的数量增加，提示海马结构参与了咬合创伤反应，推测海马的CA1、CA3区与咬合创伤所致口颌面痛及痛情绪调控关系密切，尤其CA3区，是口面部伤害性刺激的主要投射区。

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