普伐他汀对心脏成纤维细胞转化生长因子-β1合成的影响*

武宇洲，崔 炜△，李淑琴，张 雷，鲁静朝

(1.河北医科大学第二医院，河北省心脑血管病研究所心内科;2.病理生理学教研室;3.组织与胚胎学教研室，石家庄 050000)

心脏成纤维细胞是心肌纤维化的主要效应细胞，也是他汀类调脂药物的主要靶细胞。我们以往的研究发现，普伐他汀可抑制心脏成纤维细胞内皮素的合成和分泌[1]，参与抗心肌纤维化过程。近来研究表明，转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)是心肌纤维化发生、发展的主要致病因子[2]。普伐他汀是否也调节了TGF-β1的合成和分泌，在减轻心脏重塑方面发挥重要作用，尚不十分清楚。本实验观察普伐他汀对醛固酮诱导新生大鼠心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达以及TGF-β1合成和分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

出生1～3 d的SD大鼠，购于河北医科大学动物中心。醛固酮、甲羟戊酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白购于美国Sigma公司;DMEM/F12培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司;TGF-β1多克隆抗体、纤维连接蛋白多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。PCR试剂和DNA Marker购于大连TaKaRa公司;TGF-β1 ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。普伐他汀由华北制药集团有限责任公司提供。

1.2 心脏成纤维细胞的培养和鉴定

取1～3 d龄的SD大鼠，在无菌条件下开胸剪取心室，采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取和培养心脏成纤维细胞。待心脏成纤维细胞生长接近融合时以1∶3传代，实验采用已传2～4代的心脏成纤维细胞。对心脏成纤维细胞进行形态学和SABC法免疫细胞化学染色鉴定，纯度达96%(图1)。

Fig.1 Fibronectin protein expression in cardiac fibroblasts(×400)

1.3 实验分组

将心脏成纤维细胞(1×109cells/L)接种于24孔培养板和50ml的玻璃培养瓶中，待细胞生长至亚融合状态时，以1%牛血清白蛋白培养液培养预适应24h后，根据实验分组要求换用加入各种处理因素的1%牛血清白蛋白培养液继续培养。实验分组为6组:(1)正常对照组;(2)醛固酮组(10-7mol/L);(3-5)醛固酮(10-7mol/L)+普伐他汀组(10-5，10-4，10-3mol/L);(6)醛固酮(10-7mol/L)+普伐他汀(10-3mol/L)+甲羟戊酸组(10-2mol/L)。普伐他汀或普伐他汀和甲羟戊酸共同预处理心脏成纤维细胞24h后，再加入醛固酮作用8 h、24h和48 h后，分别测定心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达、细胞中TGF-β1含量和培养液中TGF-β1水平。

1.4 ELISA法检测 TGF-β1水平

按照试剂盒说明书操作，测定心脏成纤维细胞培养液中的TGF-β1 水平。

1.5 Western-blot检测 TGF-β1 含量

裂解细胞后取上清液，进行丙烯酰胺凝胶电泳;水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上，室温下封闭2 h后，加入1∶250的一抗稀释液，4℃过夜，用TPBS液洗3遍;再加 入1∶6500的HRP标记二抗稀释液，振摇1 h后TPBS液洗3遍;DAB显色后分析。

1.6 RT-PCR检测 TGF-β1 mRNA表达

提取细胞总RNA，进行逆转录反应。TGF-β1引物(上游5'-AAT ACG TCA GAC ATT CGG GAA GCA-3'，下游 5'-GTC AAT GTA CAG CTG CCG TAC ACA-3')和GAPDH引物(上游5'-AAT GCA TCC TGC ACC AA-3' ，下游 5'-GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA-3')可扩增出长度为498 bp的TGF-β1 cDNA片段和515 bp的GAPDH cDNA片段。PCR反应条件:TGF-β1:94°C变性45 s，48°C退火45 s，72°C延伸90s;GAPDH:94°C 变性45 s，48°C 退火45 s，72°C延伸90s，共进行32个循环。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳后分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 普伐他汀对醛固酮诱导的心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平的影响

与正常对照组相比，醛固酮组可促进心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平。普伐他汀预处理心脏成纤维细胞24h后，再加入醛固酮作用48 h后，分别测定心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平。与醛固酮组相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)明显减少心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平，且呈剂量依赖性(P＞0.05，P＜0.01，P＜0.01)。甲羟戊酸明显逆转了普伐他汀(10-3mol/L)对醛固酮(10-7mol/L)诱导的心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平的抑制作用(表1)。

2.2 普伐他汀对醛固酮诱导的心脏成纤维细胞中TGF-β1含量的影响

与正常对照组相比，醛固酮可增加心脏成纤维细胞中TGF-β1含量。普伐他汀预处理心脏成纤维细胞24h后，再加入醛固酮作用24h后，分别测定心脏成纤维细胞中TGF-β1含量。与醛固酮组相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)可剂量依赖性减少心脏成纤维细胞中 TGF-β1含量(P＞0.05，P＜0.01，P＜0.01)。甲羟戊酸完全逆转了普伐他汀(10-3mol/L)对醛固酮诱导的心脏成纤维细胞中TGF-β1含量的抑制作用(表1，图2)。

Tab.1 Changes of TGF-β1 mRNA ，TGF-β1 synthesis and release()

Tab.1 Changes of TGF-β1 mRNA ，TGF-β1 synthesis and release()

Ald:Aldosterone;Pra:Pravastatin;Mev:Mevalonate*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs Ald;△P＜0.01 vs Ald+Pra(10-3mol/L)

Group TGF-β1/GAPDH mRNA(n=3)Relative TGF-β1 protein(n=3)TGF-β1(ng/L)(n=6)Control 0.199±0.007 1 56.10±2.69 Ald 0.591±0.049* 2.22±0.28* 104.82±11.18*Ald+Pra(10-5mol/L) 0.505±0.029# 2.00±0.16 95.90±8.30Ald+Pra(10-4mol/L) 0.390±0.021# 1.64±0.14# 83.42±6.28#Ald+Pra(10-3mol/L) 0.214±0.013# 1.11±0.05# 64.65±5.73#Ald+Pra(10-3mol/L)+Mev 0.595±0.054△ 2.22±0.23△ 106.00±11.91△

Fig.2 Western-blot analysis of TGF-β1 expression in cultured cardiac fibroblasts

2.3 普伐他汀对醛固酮诱导的心脏成纤维细胞 TGF-β1 mRNA表达的影响

与正常对照组相比，醛固酮可增加心脏成纤维细胞TGF-β1 mR NA的表达。普伐他汀预处理心脏成纤维细胞24h后，再加入醛固酮作用8 h后，分别测定心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达。与醛固酮组相比，普伐他汀(10-5，10-4，10-3mol/L)可剂量依赖性减少心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达(P＜0.01)。甲羟戊酸完全逆转了普伐他汀(10-3mol/L)对醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达的抑制作用(表1，图3)。

Fig.3 RT-PCR analysis of TGF-β1 mRNA expression in cardiac fibroblasts

3 讨论

TGF-β1是一类具有激素样活性的多肽生长因子，是强有力的促心肌纤维化因子，是胶原纤维和其他细胞外成分合成和沉积的强有力的始动因子，可通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶的I型II型受体(一种跨膜蛋白的激酶)磷酸化，刺激心脏成纤维细胞大量增生及胶原、纤维粘连蛋白基因的转录，并能抑制蛋白分解酶对细胞外间质的分解作用，从而促进心肌纤维化的形成。研究发现普伐他汀可改善2型糖尿病大鼠的左室舒张功能，减轻心脏重塑，这一效应与其降低心肌中高表达的 TGF-β1有关[3]。另外，临床研究显示辛伐他汀他汀可减轻原发性高血压病人心肌纤维化，改善左室舒张功能，并伴有血浆TGF-β1水平下调[4]。因此，推测他汀类调脂药物可能是通过调节TGF-β1的过度表达参与抑制心肌纤维化过程的。与这些研究相一致，本实验结果显示，普伐他汀可剂量依赖性抑制醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达，以及TGF-β1的合成和释放，表明普伐他汀减轻心肌纤维化的作用可能是通过其下调TGF-β1的过度表达介导的。本研究还发现，普伐他汀抑制醛固酮诱导心脏成纤维细胞 TGF-β1 mRNA表达，以及 TGF-β1合成和释放的作用可被外源性甲羟戊酸拮抗，进一步支持甲羟戊酸途径可能参与了普伐他汀的非调脂作用。这可能与普伐他汀阻断了甲羟戊酸和这一通路上其他重要的类异戊二烯中间体的生成有关[5]，从而抑制 Ras和Rho等小分子GTP结合蛋白的类异戊二烯化修饰，导致胞浆内非活性的小分子GTP结合蛋白堆积，阻断细胞内信号转导，其所带来的临床益处已远远超过调脂作用。

鉴于TGF-β1与心肌纤维化的发生、发展密切相关，本研究从细胞、分子和mRNA水平观察到普伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达，以及TGF-β1的合成和释放，为他汀类调脂药物的临床应用作用提供了一定的实验依据。

[1]武宇洲，崔 炜，李淑琴，等.普伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素合成的影响[J].中国应用生理学杂志，2007，23(3):343-346.

[2]BujakM，Frangogiannis N G.The role of TGF-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling[J].Cardiovasc Res，2007，74(2):184-195.

[3]Yu Y，Ohmori K，Chen Y，et al.Effects of pravastatin on progression of glucose intolerance and cardiovascular remodeling in a type II diabetes model[J].J Am Coll Cardiol，2004，44(4):904-913.

[4]张国刚，张赛丹.辛伐他汀对原发性高血压心肌纤维化的影响[J].中南大学学报(医学版)，2005，30(3):280-282.

[5]Haydont V，Bourgier C，PocardM，et al.Pravastatin Inhibits the Rho/CCN2/extracellular matrix cascade in human fibrosis explants and improves radiation-induced intestinal fibrosis in rats[J].Clin Cancer Res，2007，13(18 Pt 1):5331-5340.