金荞麦片质量标准的实验研究

何美珊， 钱炳辉， 王兆龙， 王志勇， 闫玉梅

（1.南通精华制药股份有限公司，江苏南通 226005;2.上海华氏大药房有限公司，上海 200082;3.江苏飞马药业有限公司，江苏南通 226009）

金荞麦片为单方浸膏片，是国家基本药物、国家中药保护品种，具有清热解毒、排脓祛瘀、祛痰止咳平喘的功能，用于急性肺脓疡、急慢性气管炎、支气管哮喘及细菌性痢疾。金荞麦片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册［1］，以薄层色谱法鉴别金荞麦、紫外分光光度法测定总黄酮含量。为有效控制金荞麦片的质量，改进鉴别与含量测定方法，薄层色谱主斑点为（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2，用HPLC法测定（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的含量。

1 仪器、试药与样品

1.1 仪器 Waters 600E高效液相色谱仪、2487双波长紫外检测器、Millennium32色谱管理系统，Varian cary 50 conc紫外-可见分光光度计，sartorius BP211D电子天平，pHS-25型pH计（上海雷磁仪器厂）。SB5200超声波清洗器（上海必能信超声有限公司），Model-3旋转蒸发器（上海医械专机厂），800型离心机（上海手术器械厂）。D1810C自动双重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器公司、上海申科机械研究所合作出品）。

1.2 试药与样品 柱层析用聚酰胺30～60目，批号F20020709，中国医药（集团）上海化学试剂公司;薄层层析用硅胶G，青岛海洋化工厂;乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子双蒸水。

（-）-表儿茶素对照品，批号878-200102，中国药品生物制品检定所提供，高效液相色谱归一化法测定其含量为98.4%。原矢车菊素B2对照品，批号Ky020644BB，日本フナュツ株色会社提供，高效液相色谱归一化法测定其含量为95.6%。金荞麦对照药材，批号1114-200001，中国药品生物制品检定所提供。金荞麦片供试品，薄膜衣片，南通精华制药有限公司生产。

2 薄层色谱鉴别

取3.2.2项下供试品溶液5 mL，减压浓缩至干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺金荞麦的阴性制剂，同法制成阴性对照液。另取金荞麦对照药材1 g，加稀乙醇30 mL，置水浴上回流1 h，滤过，滤液减压浓缩至1～2 mL，移置10 mL具塞试管中，加乙腈-水（1∶9）至约10 mL，摇匀，离心（3 000 r/min）5 min，取上清液，照3.3.2项供试品溶液的制备项下自“加入聚酰胺柱……”起，依法收集洗脱液，减压浓缩（50～60℃）至干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取（-）-表儿茶素对照品、原矢车菊素B2对照品，分别加乙醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1∶2∶0.2∶0.1）为展开剂，展开7.2 cm，取出，晾干，喷以25%磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热约2 min至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验 Symmetry C18色谱柱，5 μm，3.9 mm id ×150 mm。流动相:水（用磷酸调pH值至3.00±0.02）-乙腈（92∶8）。流速:0.8 mL/min，检测波长:280 nm，柱温:35℃，进样量10 μL。色谱柱理论板数按（-）-表儿茶素峰计算应不低于8 000。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备 取（-）-表儿茶素对照品适量，精密称定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含（-）-表儿茶素23.9 μg的对照品溶液。取原矢车菊素B2对照品适量，精密称定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含原矢车菊素B234.4 μg的对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，取1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，精密加入乙腈-水（1∶9）25 mL，摇散，称定重量，超声处理（功率160 W，频率50 KHz）30 min，放冷，再称定重量，用乙腈-水（1∶9）补充减失的重量，摇匀，离心（3 000 r/min）5 min，精密量取上清液10 mL，加入聚酰胺柱（30～60目，3 g，内径1.0 cm，湿法装柱），用水30 mL洗脱，弃去水液，再加乙醇150 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩（50～55℃）至近干，加乙腈-水（1∶9）溶解并转移至10 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶9）至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺金荞麦的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性试验 精密吸取（-）-表儿茶素对照品溶液、原矢车菊素B2对照品溶液、金荞麦片供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图，结果显示阴性对照溶液对测定结果无干扰，见图2。

3.3.2 线性关系考察 取质量浓度分别为11.36、22.72、45.44、68.16、90.88、136.32、181.76、227.20 μg/mL的（-）-表儿茶素对照品溶液，分别进样，记录色谱图，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=1.190 198×106X+1.475 990 × 103，r=0.999 968。（-）-表儿茶素在0.113 6～2.272 μg范围内与峰面积线性关系良好。

取质量浓度分别为 16.64、33.28、66.56、99.84、133.12、166.40 μg/mL 的原矢车菊素 B2对照品溶液，分别进样，记录色谱图，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=9.541 97×105X+5.989 5 ×104，r=0.999 702。原矢车菊素B2在0.166 4～1.664 μg范围内与峰面积线性关系良好。

图2 金荞麦片HPLC图

3.3.3 精密度试验 取同一供试品溶液，重复进样5次，每次 10 μL，（-）-表儿茶素峰面积 RSD 为0.76%，原矢车菊素B2峰面积RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

3.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，于室温27 ℃的环境中放置，在 0、2、4、6、8、24 h，分别进样10 μL，记录色谱图，测得8 h内（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的RSD分别为0.66%和0.81%，24 h内（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的RSD分别为1.5%和1.67%，试验结果表明供试品溶液在本实验条件下24 h内基本稳定。

3.3.5 重复性试验 取同一批供试品6份，依法制备供试品溶液并测定，（-）-表儿茶素含量RSD为0.53%，原矢车菊素B2含量RSD为0.67%，结果表明方法重复性良好。

3.3.6 加样回收率试验 取已知（-）-表儿茶素含量为646.06 μg/g金荞麦片样品6份，每份约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入0.623 mg/mL（-）-表儿茶素对照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，称定重量，摇散，照供试品溶液的制备项下自“超声处理……”起，依法制备供试品溶液，测定。（-）-表儿茶素平均加样回收率为97.12%，RSD为0.92%，见表1。

表1 （-）-表儿茶素加样回收率试验结果（n=6）

取已知原矢车菊素B2含量598.02 μg/g金荞麦片样品6份，每份约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入0.605 mg/mL原矢车菊素B2对照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，称定重量，摇散，照供试品溶液的制备项下自“超声处理……”起，依法制备供试品溶液，测定。原矢车菊素B2平均加样回收率为98.26%，RSD为0.61%，见表2。

表2 原矢车菊素B2加样回收率试验结果（n=6）

3.4 样品测定 取金荞麦片5个批号样品，制备供试品溶液;取（-）-表儿茶素对照品、原矢车菊素B2对照品分别制备对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表3。

4 讨论

4.1 测定波长的选择 在波长190～400 nm范围内，分别对（-）-表儿茶素对照品溶液、原矢车菊素B2对照品溶液进行光谱扫描，波长280 nm左右峰形均较好，最大吸收波长为280.0 nm。

4.2 对照品与含量测定成分的选择 金荞麦有效成分为原花色素类缩合鞣质及其前体的混合物［2-4］，包括:（-）-表儿茶素［（-）-epicatechin］及其衍生物的单体、二聚体和多聚体，其中主要有效成分为原矢车菊素B2（procyanidin B2）。为了有效控制金荞麦片质量，鉴别、测定有效成分，在金荞麦片质量标准研究过程中使用（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2对照品，证实TLC主斑点、HPLC主要色谱峰均为有效成分，但原矢车菊素B2对照品分离难度大、货源稀少，本实验中所用原矢车菊素B2对照品的含量偏低（95.6%）。在金荞麦片质量标准中，TLC鉴别使用金荞麦对照药材、HPLC测定（-）-表儿茶素含量即可。

表3 金荞麦片供试品含量测定结果（n=3）

［1］中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十九册［S］.1998:103.

［2］刘永隆，房其年，张秀琴.金荞麦有效成分的研究［J］.药学学报，1983，18（7）:545-547.

［3］姚荣成，吴友仁，杨崇仁，等.云南产金荞麦根茎抗肿瘤有效部位的化学研究［J］.云南植物研究，1989，11（2）:215-218.

［4］张雯洁，李兴从，刘玉青，等.威麦宁的酚性成分［J］.云南植物研究，1994，16（4）:354-356.