湖南省规模化猪场猪源大肠杆菌耐药性调查

于桂阳

（湖南永州职业技术学院农学系，湖南 永州 425000）

规模化、集约化养殖业的持续发展离不开抗菌药物。然而，抗菌药物在养殖业的广泛使用也引起了动物源细菌耐药性的日益加重与广泛传播。动物源细菌耐药性的流行不仅加大畜禽疫病的防控难度，给养殖业造成巨大损失，而且动物源耐药菌还可通过食物链感染人体或将耐药基因转移至人体致病菌，给食品安全和人体健康带来潜在危害[1]。因此开展耐药性监测与分析对兽药残留监控发挥着积极作用，本试验重点监测猪源大肠杆菌对常用药物的耐药情况调查及分析。

1 材料与方法

1.1 病料

疑似大肠杆菌病的病料采集。病料采集时间为2010年7月，采集规模化猪场有腹泻症状仔猪肛试标本，分离来自湖南省不同县区的6个规模化养猪场共计65个病料标本的大肠杆菌致病菌株。

1.2 培养基与试纸

培养基：普通琼脂培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝培养基、MH琼脂培养基、LB培养基 （均购自北京奥博星生物技术有限公司）。

药敏纸片：氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻呋钠、安普霉素、环丙沙星、氨苄青霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、四环素和氯霉素 （头孢噻呋、氟苯尼考、安普霉素的药敏纸片自制，其他药品的药敏纸片均购自杭州微生物试纸有限公司）。微量生化反应管 （杭州微生物试纸有限公司）。

1.3 试验仪器与材料

试验材料：接种环、平皿、三角瓶、新华滤纸、游标卡尺、试管、打孔器、注射器、消毒棉签、移液器、移液管等。

试验仪器：自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）、电子天平 （北京塞多利斯仪器系统有限公司）、SWCJ-1F型单人双面净化工作台 （苏州净化设备有限公司）、GHP-9080隔水式恒温培养箱 （上海齐欣科学仪器有限公司）、DHZ-D恒温振荡摇床 （太仓市实验仪器设备厂）、LDZX-50FBS立式电热压力蒸汽灭菌器 （上海申安医疗器械厂）、DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 分离培养

用医用棉签采集有腹泻症状猪只肛门内的粪样，采集后将其装入无菌的EP管或青霉素小瓶中[2]。用灭菌的生理盐水将粪样稀释后，吸取0.5mL稀释液加入到装有5mL普通肉汤培养基的试管中，将试管置于恒温振荡摇床内37℃增菌培养12～16小时后，用接种环将培养物划线于伊红美蓝琼脂平板上，置于恒温培养箱内37℃培养16小时后用铂金耳挑取带金属光泽、中等大小、表面光滑圆润的暗红色单个菌落划线于麦康凯琼脂培养基，37℃培养16小时后挑取砖红色、中等大小、表面光滑湿润、圆形、扁平的菌落划线于斜面培养基上进行保存。对保存在斜面培养基上的细菌先涂片，再用革兰氏染液染色后，用100倍的光学显微镜进行镜检，根据细菌形态和染色特点，将革兰氏染色为阴性、两端钝圆、无芽孢、中等大小的杆菌初步判定为大肠杆菌。

1.4.2 生化试验

取分离培养物进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖的发酵试验，同时进行吲哚、M-R、VP和硫化氢试验。糖发酵试验在24小时观察结果，其他生化试验在48～72小时内观察结果。

1.4.3 药敏试验

用铂金耳在斜面上挑取少量大肠杆菌放入装有10mL MH液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于摇床内37℃培养8～12小时，取出后与BaCl2标准比浊管进行对比并进行稀释，使菌液的浓度与比浊管的浓度相当，此时菌液的浓度约为108CFU/mL。

将稀释好的菌液 （108CFU/mL）倒入MH培养基平板内，倒入的菌液量以刚好覆盖整个培养基表面为宜，让培养基表面菌液均匀分布，倒掉多余的菌液。用灭过菌的镊子夹取药敏纸片，均匀地放置在平板培养基上，每个平板上放7片纸片。纸片放好后静置10分钟，然后将平板倒置放入恒温培养箱内37℃培养18小时。将培养了18小时的培养基平板取出后置于背景为黑色的物体上，用游标卡尺精确测量抑菌圈的直径，结果以毫米 （mm）计。判定标准采用美国临床检验标准委员会（NCLLS）标准判定药物的敏感性，见表1。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

大肠杆菌在普通琼脂平板上长出灰白色露珠样光滑、隆起、边缘整齐的菌落。在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小的红色菌落。在伊红美蓝琼脂平板上，形成带有金属光泽的紫黑色小菌落。对65份样品进行分离纯化，分离到了58份大肠杆菌菌株，大肠杆菌分离率89.2%，大肠杆菌分离情况见表2。

2.2 显微镜检查

在光学显微镜下对分离菌株进行油镜观察，杆菌呈短杆状、成簇分布或散在，革兰氏染色阴性，符合大肠杆菌的形态。

2.3 生化试验结果

从表3可以看出，58株分离的菌株均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、不发酵蔗糖。M-R试验、吲哚试验为阳性，VP试验阴性，不产生H2S，生化反应的符合率均在96%以上，其中葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等四项生化反应符合率均达到100%，乳糖、M-R试验和VP试验等生化反应符合率98.3%，吲哚试验和硫化氢试验的生化反应符合率96.6%，符合大肠杆菌的生化特性。因此根据生化试验的结果可鉴定分离菌株为大肠杆菌。结果见表3。

2.4 药敏试验结果

从表4可以看出，58株致病性大肠杆菌对13种受试抗菌药物均有不同程度的耐药性。对大肠杆菌耐药率在70%以上的药物有四环素、氨苄青霉素、恩诺沙星、阿莫西林、链霉素、诺氟沙星和环丙沙星等七种药物，它们耐药率分别为94.8%、91.4%、86.2%、81.0%、79.3%、74.1%和72.4%；耐药率在30～70%之间的药物有庆大霉素、氯霉素和头孢噻呋钠三种药物，它们耐药率分别为63.8%、63.8%和51.7%；耐药率在30%以下的药物有氟苯尼考、丁胺卡那霉素和安普霉素三种药物，它们耐药率分别为29.3%、25.9%和5.2%。

从图1可以看出，抗菌药物中敏感率最高的为安普霉素 （84.4%），其次为丁胺卡那霉素 （60.3%）。这可能与临床上这两种抗菌药物的使用频率较小有关。

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3 分析与讨论

3.1 猪源大肠杆菌的耐药情况分析

本试验应用了13种抗菌药物对湖南地区分离的58株猪源致病性大肠杆菌进行了药物敏感性试验，实验结果显示，猪源大肠杆菌分离菌株对目前常用和应用时间较长的抗菌药物，如四环素、氨苄青霉素、恩诺沙星、阿莫西林、诺氟沙星等产生了非常严重的耐药性。猪源大肠杆菌分离株对于一些新药和未大量应用于猪场的药物如安普霉素、丁胺卡那霉素等则比较敏感。因此细菌耐药性与用药情况密切相关。

3.2 猪源大肠杆菌耐药特点

大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，试验结果显示，13种抗菌药物对大肠杆菌均有不同程度的耐药性，除安普霉素耐药率只有5.2%外，其它12种抗菌药物耐药率均超过25%以上，尤其是氟喹诺酮类药物作为一种较新的抗菌药物，其耐药率不断增加。值得注意的是，通过比较相关研究数据，发现近年来猪源大肠杆菌的耐药菌谱和耐药率不断增加。例如，2004年淮安地区分离的大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率达30%。2007年分离的大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率已达到40%左右，其中恩诺沙星的耐药率40.7%。本试验分离大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率为77.6%，其中恩诺沙星的耐药率86.2%，呈现大幅度地上升，本试验其它类抗菌药物的耐药性也出现类似现象[3]。耐药产生的原因主要是临床滥用药，没有注意用药的交替性以及饲料添加药物，从而导致细菌对抗菌药物表现不同程度的耐药性[4]。同时大肠杆菌一旦获得耐药性后，对大多数药物的耐药能力可超过常用治疗量的数倍至数十倍，形成被膜后耐药能力可超过常用治疗量的数千倍。

目前，大肠杆菌的耐药性已非常普遍，临床上分离的致病性大肠杆菌几乎都有耐药性，而且不止耐受一种药物，因此，我们选择药物时不能仅靠经验，而要根据药敏试验选择敏感药物，或使用经过科学研究的复合制剂进行治疗，才能达到有效治疗，减少耐药菌出现的目的。

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3.3 耐药性与兽药残留

图1 敏感率高的前5种抗菌药物

长期使用抗菌素和滥用抗菌素是药物残留及细菌耐药性产生的源头。对人类健康构成最大威胁来源于长期使用抗菌素或滥用抗菌素引发的耐药性细菌生长和抗药基因的转移[5]。长期使用抗菌素或滥用抗菌素和耐药性是一对孪生兄弟，耐药性不但主要源于治疗人类疾病时大量使用抗菌素，还包括动物生产过程中长期使用抗菌素，使耐药性的危害越来越严重，安全性隐患日趋突出[6]。本调查以大肠杆菌为指示菌研究了规模化猪场的细菌耐药情况，大肠杆菌作为耐药性的指示菌能够从一个侧面反应细菌的耐药性。试验结果显示，猪源致病性大肠杆菌耐药率增强，耐药普扩大。随着抗菌药大量、广泛的使用，加快了细菌耐药性的发展，很多细菌对药物由敏感逐渐变为耐药，或由低水平耐药转为高水平耐药，由单一耐药发展到多重耐药［7］。由于饲料中添加抗菌药物，一方面增加了动物性食品中的兽药残留，促进人源性细菌耐药性增加的可能，从而导致人类发生感染后使用抗生素无效或药效下降，对人体健康构成威胁；另一方面也导致动物源性细菌耐药性的增加，由于耐药菌株不断出现而导致抗生素治疗无效给畜牧业带来严重的经济损失，同时病原微生物的耐药性增强，医疗效果不佳，在此情况下，在养猪生产中使用抗菌药物控制各种感染性疾病，剂量、范围、种类的不规范使用，导致耐药菌株的产生和细菌耐药率的增加，随着耐药菌株的日益增多，抗菌药物对细菌性疫病的防治效果越来越差，药物用量也越来越大，如此形成恶性循环，猪病越来越多，药越用越多，兽药残留问题也越来越严重，从而影响畜禽产品质量，威胁人类健康。因此，猪场在应用抗菌药物进行临床治疗时，不应仅凭经验用药，有条件的猪场最好根据药物敏感性试验的结果选择敏感性高的药物，并充分考虑这些药物本身特性和药物之间的复杂关系，采取联合或交替用药，并做到用药适量，提高药物防治疾病的效果。

[1]邱春媚，何家康，毕玉海.猪源大肠杆菌的耐药性调查与对策.猪业科学，2008（08）：38-40

[2]樊国燕，臧金灿，边传周．规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测.河南农业科学，2008（3）：110-112

[3]赵坤，王三虎，张婷，赵恒章，等．豫北地区猪源致病性大肠杆菌的耐药性研究.河南科技学院学报：自然科学版．2008，36（1）：59-61

[4]田国宝，王红宁，黄勇，柳苹，等．规模化猪场大肠杆菌耐药性和血清型变化趋势例. 中国兽医杂志，2007，43（10）：31-33

[5]张广群，王春光，张国磊，吕建存，等．55株猪源大肠杆菌的耐药性监测.中国动物检疫，2006，23（2）：34-35

[6]杨柳，王思芦，罗音久，曾中良，等．对规模化猪场大肠杆菌耐药性的调查.四川畜牧兽医，2006（5）：26-27

[7]陈宇，方雪燕，吴晓鸣．某规模化猪场大肠杆菌的耐药性情况分析.福建畜牧兽医，2006，28（5）：9-10．