环境污染物与生物大分子相互作用的光谱法研究进展

研究表明，环境因素是导致人类肿瘤的重要诱因之一。随着科学的发展与社会的进步,越来越多的化合物进入了人类的生产和生活环境。外源小分子与蛋白质、核酸等生物大分子相互作用的研究涉及许多相关学科，如生物学、化学、医学、药物化学、物理学及计算化学等，一直是相关交叉领域的研究热点。一般而言，外源小分子与生物大分子的靶部位作用后，将使后者发生变化，继而引起一系列生物体内的物理变化或化学变化，最终体现为效应。血清白蛋白、DNA与小分子间的超分子作用，因其在药物设计与合成及药物作用机理研究等方面的重要意义，引起了众多学者的关注。作者在此对环境污染物与生物大分子相互作用的研究现状进行了综述，重点介绍了光谱法研究进展。

1 环境污染物与DNA相互作用的研究现状

靶向分子与DNA结合的部位是DNA的碱基、磷酸骨架和戊糖环，即DNA由平行的碱基、聚阴离子磷酸骨架以及大沟和小沟组成了靶向分子识别的位点。非共价键结合主要包括静电、沟区、插入等几种作用方式。

早在20世纪60年代，人们就发现蒽环化合物的蒽环平面可以嵌入DNA而形成加合物。一些致癌物也能与DNA形成加合物，这种DNA加合物都是由DNA经转录、翻译等过程产生的，也是可能癌变的预警标志物质。因此，环境化学污染物与DNA相互作用的研究对于揭示某些基因突变的原因、寻找快速测定基因突变的方法以及相应的基因治疗药物具有重要意义。目前，国内外在此领域研究报道尚不多，环境污染物与DNA相互作用研究总结见表1。

表1 环境污染物与DNA的相互作用

环境化学物质有机磷、氨基甲酸酯类农药[1～7](如马拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、氰戊菊酯)以及环境污染物蒽[8]等与DNA的作用已见诸报道。任丽萍等[9]发现阿特拉津-ctDNA在319.8 nm处有一增强的共振光散射光谱峰，且共振光散射强度与ctDNA的浓度呈线性关系，据此建立了测定痕量DNA的方法。段云青等[19]研究了抗凝杀鼠剂溴鼠灵与小牛胸腺DNA的相互作用。这些研究表明，小分子化合物与DNA的结合模式主要是通过静电、沟区、插入等非共价键方式结合，如氢键、离子键、范德华力和疏水作用等。虽然这些均属于弱作用键，但在分子水平的生命现象中却是决定性的因素。

2 环境污染物与蛋白质相互作用的研究现状

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是人和动物体内血液中含量最丰富的蛋白质，容易较大量、高纯度地制备。同其它蛋白质比较，SA分子量较小、溶解性较大、稳定性较好、带有净负电荷，且能与体内许多内源性物质及许多外源小分子配体相互结合，因而成为研究蛋白质在体内代谢、生物学功能、临床应用及遗传变异等方面的理想蛋白质，也是此类研究中应用最为广泛的蛋白质。环境污染物进入人体后，先与SA结合，然后被转运到其它组织部位释放出来，产生危害作用。近年来，国内外学者主要集中于研究污染物的宏观毒性，关于其与生物分子特别是典型的生物大分子SA的相互作用则鲜有报道。环境污染物与血清白蛋白相互作用研究总结见表2。

表2 环境污染物与血清白蛋白的相互作用

Purcell等[20]研究了除草剂阿特拉津和2,4-二氯取代的阿特拉津与人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)的相互作用，发现二者均引起蛋白质的二级结构发生变化，α-螺旋结构减少，β-折叠以及其它结构增加。百草枯是一种速效触杀型灭生性除草剂，对人畜毒性较强[21]。颜承农等[22]和Zhang等[23]分别采用紫外和荧光方法详细研究了百草枯与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及HSA的相互作用。王月等[24]模拟环境中的复杂体系，通过测定典型有机污染物邻、间、对硝基苯胺共存时与BSA的相互作用结合常数，评价三种硝基苯胺共存时与BSA结合强度的大小，建立了一种基于分子水平亲和作用原理的快速毒性评价方法。

3 外源分子与蛋白质或DNA相互作用的光谱研究方法

DNA分子中的碱基和蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等氨基酸残基都具有特殊的光学活性。许多外源小分子或本身具有光学活性，或与SA和DNA大分子结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过考察SA和DNA大分子结合小分子后结构上的变化来研究结合机理，是非常有效和应用最广泛的方法。常用的光谱法包括紫外可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法和圆二色光谱法等。

3.1 紫外可见光谱法(UV-Vis spectrum)

DNA分子的紫外可见光谱在260 nm左右有最大吸收。许多外源分子与DNA结合后，DNA或外源分子的吸收光谱都会发生变化，如引起吸收带的红移(蓝移)现象或增色(减色)效应，因此，用紫外可见吸收光谱法来研究DNA与外源分子的结合机理，是非常有效和应用广泛的方法。刘伟等[3]利用吸收光谱法对毒死蜱、氰戊菊酯和马拉硫磷与DNA作用的研究表明，三者均能引起DNA的紫外谱图发生波长位移和减色效应，推断它们可能加合到DNA的亲核位点，对DNA造成损伤。孙英等[5]对3种氨基甲酸酯类农药与ctDNA作用的紫外光谱研究表明，它们能插入DNA的螺旋双链，通过形成DNA加合物的形式导致基因突变，最终对生物体的DNA产生化学损伤。同样，一些小分子配体与蛋白质结合后,其分子结构发生了一定的变化，相应出现了吸收峰位移或谱峰宽度的变化，据此可研究蛋白质与小分子间的结合强弱和结合机理。童沈阳等应用吸收光谱法对多种染料与蛋白质BSA的结合反应机理及结合参数进行了系统研究[34～36]。

3.2 荧光光谱法(Fluorescence spectrum)

蛋白质分子中含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)三种芳香族氨基酸残基，在紫外光照射下会发射荧光(图1)，所以蛋白质属于内源性荧光物质，可直接根据作用物对其内源荧光的猝灭或加强程度来考察相互作用的机理及结合强度；荧光测试中的发射峰特征、能量转移等指标可为蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境研究提供有用信息；根据能量转移机理，可以求出结合于蛋白质的外源分子距蛋白质中色氨酸的距离;通过外源分子与结合部位已知的荧光探针竞争蛋白质结合部位，可以确定药物在蛋白质上的结合部位;利用荧光探针，可以研究蛋白质分子的构象。由于荧光探针具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，近年来在蛋白质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。Demant[37]研究了BSA与7-羟基香豆素-4-乙酸所形成的共价配合物BSA-HCA的荧光性质，并以此化合物为荧光探针建立了定量测定脂肪酸的方法。Yang等[38,39]在发展蛋白质与小分子化合物相互作用的荧光研究法及荧光探针方面做了大量工作。

图1 血清白蛋白中Trp、Tyr及Phe的荧光光谱

DNA虽无内源荧光，但可通过荧光探针法来研究其与荧光体或其它化合物的作用，小分子与DNA的键合方式也直接影响着稳态荧光光谱[40,41]。溴化乙锭是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与DNA作用的研究[41,42]。Zhou等[43]应用荧光法研究了胺类化合物与DNA的相互作用模式。通过考察典型荧光猝灭剂如KI和K4Fe(CN)6对小分子荧光的猝灭作用也可以判断小分子与DNA之间的作用方式。当小分子与DNA属于嵌插作用时，猝灭剂的猝灭作用减弱；而当小分子与DNA属于沟槽作用时，猝灭作用增强。

三维荧光光谱法是近20年来发展起来的荧光分析新技术。它不仅可以提高测量的灵敏度和对分子结构的选择性，而且能够更加全面地展现样品的荧光信息，有利于综合考察样品的组分分布及构型变化特征，能直观地观察Trp残基在蛋白质分子的微环境中以及不同条件下的构象变化，有望得到广泛的应用。鄢远等[44]将三维荧光光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象，颜承农等[22]研究发现百草枯存在时，BSA三维光谱峰出现不同程度的降低，大剂量百草枯可对BSA构象产生严重影响，从而使BSA失去活性功能。

3.3 荧光偏振技术(Fluorescence polarization)

偏振是荧光分子按照偏振激发方向的光取向的结果。在粘度小的溶剂(如水)中，当激发光位于荧光分子主吸收带且没有发生分子间能量损失时，其偏振度与荧光分子的转动速度有关，转动速度快，荧光偏振小；反之，转动速度慢，荧光偏振大。对荧光样品进行退偏振观测可用来确定蛋白质的变性作用、蛋白质和小分子配体的结合反应以及蛋白质的旋转速率等。一般而言，蛋白质的偏振度降低，说明离子与蛋白质之间发生了相互结合作用[45]。小分子与DNA作用后荧光偏振的变化情况也是判断小分子是否与DNA发生嵌插作用的一个标准。通常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振会随之变大，而非嵌插作用不会引起荧光偏振的增大[46]。

3.4 同步荧光技术(Synchronization fluorescence spectrum)

同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下测绘荧光光谱图，可以提供荧光功能团附近微环境的变化。Miller[47]用同步荧光技术分别测得蛋白质分子中Trp和Tyr的特征光谱，而用普通的荧光光谱就无法获得。Δλ为15 nm 的同步荧光光谱图显示了蛋白质中酪氨酸残基的光谱特征，而Δλ为60 nm 的同步荧光光谱图仅表现出色氨酸残基的光谱特征[48～50]。氨基酸残基的最大荧光波长与其所处环境的疏水性有关，如果氨基酸所处环境的疏水性降低，则其最大发射波长红移，所以由荧光波长的改变可判断蛋白质二级结构(构象)的变化[51]。周能等[52]研究了苏丹Ⅰ与BSA的作用，结果表明，随苏丹Ⅰ浓度的增大，Trp和Tyr残基的同步荧光光谱的最大波长保持不变，说明苏丹Ⅰ的加入没有引起BSA的构象变化，但苏丹Ⅰ更易靠近Trp残基。

3.5 共振 Rayleigh 散射光谱(Resonance Rayleigh scattering，RRS)

共振 Rayleigh 散射光谱也称瑞利光散射(RLS)，是一类入射光与反射光波长相同的光散射，属于同步发光。自从1993年Pasternack等[53]首次用共振光散射技术对卟啉类化合物在核酸上的聚集进行研究之后，揭开了光散射技术在分析化学方面应用的序幕并使光散射技术逐步成为仪器分析方面的重要补充。Feng等[54]、刘绍璞[55]利用卟啉、染料等在蛋白质、核酸等生物大分子上聚集组装时产生的RRS信号与生物大分子浓度之间的线性关系，建立了RRS测定生物大分子的新分析方法，从而开辟了RRS在分析化学中的应用新领域。马春琪等[56]指出RRS信号改变可归结为两个原因，即散射体几何尺寸的变化和散射体电子离域程度的变化。

3.6 圆二色光谱(Circular dichroism，CD)

圆二色光谱以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息。B型DNA 圆二色光谱图(图2)中有一强度相当的正峰和负峰，275 nm处强的正峰是由于DNA的碱基对堆积而产生的，245 nm处的负峰是由于DNA的双螺旋结构而产生的[57,58]。因此，当外源物质加入到DNA中时，根据DNA圆二色光谱图峰的变化可以判断外源小分子对DNA结构的影响。而对一些本身没有CD信号，但与DNA结合后能产生诱导CD信号的分子，也可获得一定的有关其结构变化的信息。例如，Tuite等[59]研究了亚甲基蓝与DNA作用的诱导CD谱，对亚甲基蓝与不同碱基序列DNA结合的方式及序列选择性进行了详细的比较。Leng等[60]研究了道诺霉素与DNA作用前后产生的诱导CD谱的变化。

图2 ctDNA的圆二色光谱

蛋白质的CD谱一般分为两个波长范围：185～245 nm为远紫外区CD谱，245～320 nm为近紫外区CD谱。不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收强弱都不相同。一般而言，远紫外双负峰(209 nm和222 nm左右的两个负峰)是α-螺旋结构的典型谱形，其形状与主链构象密切相关(图3)[61]。β-折叠的CD谱在215 nm有一负峰，研究发现，β-折叠的CD谱与溶剂有较密切的关系，因此相应地,β-折叠的椭圆率值不如α-螺旋恒定，无规卷曲在198 nm的负峰并在220 nm附近有一个小而平宽的正峰。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息。

图3 多肽的圆二色光谱

3.7 拉曼光谱(Raman spectrum)

拉曼光谱是一种富含信息的分析技术，该方法可以分析作用前后不同基团振动谱带的变化，从而判断外源分子与DNA相互作用的结合机理及作用位点。其最大优点就是通用性好，因而不论在均相还是多相介质中都可以方便地应用，并有可能提供多相微环境对其它分子与DNA相互作用的影响。激光拉曼光谱能够显示血清白蛋白分子中肽键的特征性振动谱带、主链骨架的振动谱带以及侧链的振动谱带。因此，可以利用肽键的特征性振动谱带作为指标来推断血清白蛋白主链构象，Langlais等[62]借助拉曼光谱对一些金属与ctDNA相互作用的构象变化、结合位点的研究表明，金属离子浓度较低时，金属离子与DNA上的磷酸基团结合，并导致聚核苷酸结构的微小变化。

3.8 红外光谱(Fourier transform infra-red spectrum，FTIR)

傅立叶变换红外光谱以及与之相应的傅立叶自卷积和二阶导数谱的分析也可用于蛋白质二级结构的指认，从而成为一种新的研究生物大分子与小分子相互作用的手段[63～65]。蛋白质红外光谱的酞氨I带主要是其氨基酸残基的C=O伸缩振动吸收，各种不同的二级结构与羰基和酰胺的氢之间形成的氢键有关。关于蛋白质酰胺I带谱峰归属一般为：1650～1658 cm-1为α-螺旋；1610～1640 cm-1为β-折叠；1658～1695 cm-1为β-转角；无规卷曲的吸收子带在1657 cm-1左右。Tang等[27]采用荧光光谱、傅立叶变换红外光谱联合计算机模拟技术研究了灭鼠剂敌鼠与HSA的相互作用。结果表明，与敌鼠作用后，HSA的α-螺旋含量降低，β-转角含量增加，而β-折叠几乎没有变化。

4 结语

随着各种光谱技术不断发展，新的理论及实验技术不断涌现，以及对SA及DNA立体结构的清晰了解，外源小分子与DNA、蛋白质相互作用的研究不断深入，光谱技术在环境污染物与生物大分子相互作用的研究中发挥着更为重要的作用。

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