一株纤维素降解细菌的筛选、鉴定及特性研究

随着现代工业的发展、世界人口的增长，化石能源对环境造成巨大危害，人类越来越意识到寻找清洁可再生能源的迫切性。来源于生物质原料的燃料乙醇以其可再生性、无污染性、不引起温室效应等特点而被公认为最有工业应用前景的可再生能源之一，因而得到了广泛的研究。

我国的纤维素资源非常丰富，仅农作物秸秆，每年就达6～10亿t[1]。近年来， 对秸秆类纤维素物质的利用主要采用生物法， 即利用微生物将纤维素、半纤维素降解并转化为菌体蛋白[2]，所以分离和筛选高效产酶的菌种显得极其重要，但目前所筛选的高效纤维素降解菌多为真菌，生长较慢，且菌体产色，不适于工业应用。

作者在此筛选出一株可利用玉米种皮纤维作为底物、高效产纤维素酶的细菌，对扩大纤维素降解菌种的筛选和应用范围具有重要意义。

1 实验

1.1 材料与试剂

柠檬叶样品：自然界采集，用生理盐水清洗，风干后处理成小段，备用。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液：称取1 g CMC-Na，加入100 mL水，水浴加热使溶解，再加入pH值5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液20 mL、水40 mL混匀，即得CMC-Na溶液。

DNS试剂参照文献[3]配制。

1.2 培养基

1.2.1 CMC-Na筛选培养基[4]

CMC-Na 10.0 g，尿素 1.0 g，KH2PO42.0 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.5 g，蛋白胨1.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1000 mL，pH值为 5.0。

1.2.2 刚果红分离筛选培养基[5，6]

KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，琼脂18.0 g，明胶2.0 g， CMC-Na 2.0 g，刚果红0.20 g，蒸馏水1000 mL，pH值为5.0。

1.2.3 产酶培养基

玉米皮20 g，KH2PO42 g，CaCl20.5 g，吐温-80 2 mL，CoCl20.5 mg，蒸馏水1000 mL，pH值为5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌种初筛

将处理好的柠檬叶样品放到CMC-Na筛选培养基平板上，于36℃培养48 h，观察菌落形态。

1.3.2 菌种复筛

将划线分离得到的单个菌株富集培养后分别点种到刚果红分离筛选培养基平板上，于30℃培养3 d，观察有无透明圈。

1.3.3 菌种鉴定

1.3.3.1 菌种基因组DNA PCR模板的制备

取对数生长期的菌株1.5 mL，于13 000 r·min-1离心1 min，去上清，双蒸水洗涤1次；再于13 000 r·min-1离心1 min，沉淀悬浮于200 μLTE缓冲溶液中， 沸水煮10 min；冰浴10 min，再于13 000 r·min-1离心5 min，将上清液储存于-20℃，取1 μL用于PCR反应[7]。

1.3.3.2 PCR反应条件

PCR反应条件[4]：94℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 8 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选择理想的PCR产物送至北京索莱宝生物工程技术服务有限公司进行DNA测序。

1.4 葡萄糖标准曲线的绘制

用电子天平准确称取0.250 g 葡萄糖，用蒸馏水溶解定容至250 mL，即得1.0 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。分别取上述标准溶液5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL于50 mL容量瓶中，稀释定容；再分别取2 mL配制好的溶液，加入1.5 mL DNS试剂于沸水中加热15 min显色后，以蒸馏水作参比，在554 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标、葡萄糖浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程[3]。

1.5 酶活测定

取0.5 mL稀释10倍的酶液，加入1.5 mL 0.625%羟甲基纤维素(CMC)溶液，于50℃保温30 min，加入2 mL 10%的氢氧化钠溶液终止反应，再加入3 mL DNS试剂，于沸水中煮15 min，在554 nm处测吸光度。根据标准曲线或线性回归方程计算酶活[3]。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线(图1)

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 透明圈与菌落形态(图2)

图2 透明圈照片(a)及菌落形态(b)

由图2可以看出,在刚果红-CMC培养基上的菌落周围形成明显的透明圈，证明菌落周围的纤维素被降解。

2.3 菌种鉴定

根据16S rDNA序列比较推测细菌间进化关系，进而对未知细菌进行鉴定和检测[1]。经NCBI上BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov) 同源性检索和分析，发现菌株与Bacillussubtilis的16S rDNA序列有98%的同源性,因此初步确定其属于枯草芽孢杆菌，命名为L13。

2.4 温度对CMCase酶活的影响

在装有100 mL产酶培养基的250 mL三角瓶中加入5%处在对数生长期的L13菌液，于pH值5.0、150 r·min-1条件下振荡培养，每组3个平行，考察温度对产酶的影响，结果如图3所示。

图3 温度对CMCase酶活的影响

由图3可以看出,菌株L13在50℃时产酶效果最好,CMCase 酶活最高达到4.02 U·mL-1。这可能是因为温度过高或过低，均不利于酶的积累，从而影响产酶效果。

2.5 pH值对CMCase酶活的影响

在装有100 mL产酶培养基的250 mL三角瓶中加入5%处在对数生长期的L13 菌液，于50℃、150 r·min-1条件下振荡培养，每组3个平行，考察pH值对产酶的影响，结果如图4所示。

图4 pH值对CMCase 酶活的影响

由图4可以看出,菌株L13在pH值5.0时产酶效果最好，CMCase酶活最高达到5.21 U·mL-1。这可能是因为，偏酸性的环境是菌种的适宜生长条件。

3 结论

(1)应用PCR扩增、16S rDNA测序及序列分析等技术，初步鉴定纤维素降解细菌为枯草芽孢杆菌。

(2)在50℃、pH值为5.0的条件下，菌株L13产酶效果最好，酶活最高达到5.21 U· mL-1。说明枯草芽孢杆菌对纤维素有较好降解能力，在处理农村大量秸秆和城市有机废弃物方面有非常广阔的应用前景。

参考文献：

[1] 蔡燕飞，李华兴，彭桂香，等.纤维素分解菌的筛选及鉴定[J].林产化学与工业，2005，25(2)：67-70.

[2] 李日强，王爱英，孔令冬.一株纤维素分解菌的分离选育[J].山西大学学报(自然科学版)，2006，29(3):317-320.

[3] QB 2583-2003，纤维素酶制剂[S].

[4] 安明泉.纤维素降解菌的筛选分离与产纤维素酶的特性研究[D]. 北京：中国石油大学(北京)，2008.

[5] 叶姜瑜.一种纤维素分解菌鉴别培养基[J ]. 微生物通报，1997，24(4)：251-252.

[6] Teather Ronald M,Wood Peter J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J]. Appl Environ Microbiol,1982，43(4)：777-780.

[7] 刘秋云，罗樨，何康泽，等.快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板[J]. 微生物学通报，2001，28(5)：77-84.