桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定

近年来,全世界对能源的需求量急剧增加，加速了对有限的不可再生矿物能源的消耗。因此，可再生的、清洁的生物质能成为人们关注的热点，其中燃料乙醇工业在世界范围内得到了广泛的发展，而以大量木质纤维素生物质材料为基础的燃料乙醇行业更是热点中的焦点[1]。

迄今较成熟的燃料乙醇的生物转化方法是以玉米、小麦等粮食为原料，但其原料成本高昂，同时受到人口增加和耕地减少的限制。而贮存于作物秸秆中的木质纤维素来自植物的光合作用，是地球上可用于生产生物燃料最丰富、最廉价的可再生资源[2]，利用木质纤维素生产乙醇是降低燃料乙醇生产成本的根本出路。巴西、瑞典、日本、美国等发达国家正在推行可再生纤维素原料酶水解生产乙醇的能源计划。已研究出30多套植物纤维原料酶水解技术路线，有的达到相当大的实验工厂生产规模。目前，国内外秸秆乙醇生产工艺已经打通，但成本太高。

木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性及其化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。因此,要彻底降解纤维素，提高秸秆的降解性能，必须首先解决木质素的降解问题[3]。

由于木质纤维原料致密复杂的结构及纤维素分子高度结晶的特性，需要进行适当的预处理，以降低纤维素的结晶度，增加纤维原料的多孔性，脱除木质素的保护作用，增加酶与底物的接触面积，从而提高酶解的效率[4]。采用的预处理方法应满足以下要求：(1)有利于酶水解过程的糖化；(2)避免碳水化合物的降解或损失；(3)避免生成对后续水解或发酵有害的副产物；(4)经济可行。预处理方法归纳起来包括蒸汽爆破法、化学法、物理化学法和生物法等[5]。这些方法要做到经济可行却很不容易[6,7]。

在木质素生物降解过程中真菌起主要作用，而细菌主要是使木质素在一定程度上发生变性，成为水溶性的聚合物。对木质素有降解作用的细菌主要有厌氧梭菌、 不动杆菌、 黄杆菌、 微球菌、 假单胞菌、 双芽孢杆菌、 黄单胞菌、 枝动杆菌等。真菌主要有三种：白腐菌、 褐腐菌、 软腐菌。其中白腐真菌的降解能力最强，开发利用前景较好。近年来，研究也发现了一些非常规降解菌种，如Elenasláviková发现的一株酵母菌(Trihosporonpullulans)对木质素有较好的降解能力[8]。

天牛是鞘翅目昆虫中一个很大的类群，其大多以木质纤维材料为食，如林木、果树、桑、茶、棉、竹、木建材料等。早在20世纪初，天牛分解利用纤维素的研究便已开始[9]。作者以桑粒肩天牛(Apironagermari)幼虫和成虫的肠道为材料，筛选木质纤维素分解菌，从中发掘新的资源微生物和功能微生物。

1 实验

1.1 材料

供试昆虫：桑粒肩天牛(Aprionagermari)幼虫和成虫，采于湖北省公安县，寄主植物为杨树,实验前断食1 d,排除体内食物残渣。

1.2 培养基

纤维素-刚果红选择培养基：(NH4)2SO44.3 g,MgSO40.25 g,KH2PO40.5 g,CaCl20.3 g,纤维素粉1.88 g,琼脂 18 g,刚果红0.2 g,蒸馏水1000 mL。

苯胺蓝(Azure-B)培养基:木质素10 g，(NH4)2SO44.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO44.3 g，CaCl20.3 g，苯胺蓝0.1 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL。

纤维素发酵培养基：CMC-Na 20 g，(NH4)2SO44 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，蒸馏水1000 mL。调节pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30 min。

木质素发酵培养基：木质素10 g，蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2O 3 g，KH2PO43 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL。调节pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30 min。

1.3 菌株筛选方法

剪去桑粒肩天牛成虫触角、翅和足，用75%酒精浸泡3 min，解剖，取其肠道，用细线将肠道分前中肠、后中肠、后肠系紧,将这3部分剪开，分别置于装有10 mL无菌水的离心管中，充分振荡，稀释度至10-6级。

取不同稀释度的样品接种于纤维素-刚果红培养基，分别置于37℃、28℃恒温培养箱中培养。根据红色培养基变色程度、水解圈大小，挑选单菌落至以CMC-Na为唯一碳源的固体培养基中复筛，观察菌落生长情况，根据菌落的生长速度及CMC-Na的液化程度选出纤维素分解能力较好的菌株。

取不同稀释度的样品接种于以木质素为碳源的培养基，25℃培养7 d。将平板置于白色背景下，观察有无透明圈(有透明圈表示木质素被降解)。挑取单菌落至含苯胺蓝培养基平板中，25℃避光培养10 d，每天观察记录，以苯胺蓝培养基中菌落的脱色圈的有无及产生快慢和脱色圈的大小定性筛选出产酶快、酶活高的菌株。

1.4 菌种鉴定

参照李阜隶等[10]的方法分离、挑选细菌、革兰氏染色和芽孢染色。生理生化鉴定参照文献[11]。

1.5 酶活测定

纤维素降解酶活性测定：DNS法；锰过氧化物酶(Mnp)活性的测定：参考文献[12]；木质素过氧化物酶(Lip)活性的测定：参考文献[13]；漆酶(Lac)活性的测定：以愈创木酚为底物，3 mL反应体系中含50 mmol·L-1(pH值4.5)的乳酸钠缓冲溶液 1.6 mL、0.5 mmol·L-1愈创木酚0.4 mL、酶液1.0 mL，30℃反应3 min后于485 nm测定吸光度。1个酶活力单位定义为每分钟氧化1 μmol愈创木酚所需的酶量。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选分离

利用纤维素-刚果红选择培养基和苯胺蓝(Azure-B)培养基，从桑粒肩天牛肠道内筛选出5株在两种培养基上均有明显水解圈的菌株。说明菌株对纤维素和木质素都有降解作用，可能其表达的各种酶系的协同作用较强,对木质纤维素底物作用能力较强。挑选两种培养基上水解圈最大的菌株C5进行下一步的研究。

2.2 菌株的鉴定

根据菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色的显微观察结果，从不同特征的分离株中得到菌株的菌落形态和培养特征见表1。

表1 菌落形态特征

对菌株C5进行生理生化鉴定，结果见表2。

表2 生理生化鉴定结果

综合表1、表2结果，参考伯杰士细菌分类手册和常见细菌系统鉴定手册[11],基本确定该菌株为枯草芽孢杆菌。

2.3 纤维素酶活的测定结果

通过液体发酵实验，考察C5的产纤维素酶效果，结果见图1。

图1 纤维素酶活力测定结果

由图1可知，纤维素酶活随着发酵时间的延长而增加。48 h时，酶活为0.49 IU· mL-1，72 h时，纤维素酶活最大，为0.51 IU· mL-1。36 h时菌浓达到最大为2.35×107cfu· mL-1，表明C5菌产生纤维素酶基本上和菌体的生长同步。

2.4 木质素酶活的测定结果

木质素降解酶主要有 3 种:木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)和漆酶(Lac)，但并不是每种菌都能产生这3 种酶。Lip是一种来源于真菌的过氧化物酶，是降解木质素的过氧化物酶系的主要成分[14]。实验发现，C5的发酵液中没有检测到Lip的活力，这可能和细菌的特性有关，该菌可能不产Lip，基本上和文献报道的Lip主要存在于真菌中的结论相符[12]。木质素酶活的测定结果见图2。

图2 木质素酶活测定结果

由图2可知，Mnp在96 h达到最大值0.1841 IU· mL-1。Lac酶活在48 h就达到最大值0.0633 IU· mL-1，随着发酵时间的延长，Lac酶活呈下降趋势，可能在后期的生长中，产生了该酶的抑制剂或被分解。

3 结论

从桑粒肩天牛肠道中筛选得到了1株具有降解纤维素和木质素能力的细菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌。通过平板和液体发酵验证，基本上可以确定其具有降解木质素的酶活，特别是锰过氧化物酶的活力和漆酶的活力较高。该菌株同时具有降解纤维素和木质素的作用，为木质纤维素材料的降解提供了重要资源，对进一步研究木质纤维素材料的转化具有重要的意义。

参考文献：

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