HPLC法测定原料药中硫酸氢氯吡格雷及有关物质含量

氯吡格雷是一种新型的噻吩并四氢吡啶类衍生物，具有不可逆抑制血小板聚集的作用。临床上使用的主要是其硫酸盐硫酸氢氯吡格雷，可用于防治因血小板高度聚集引起的心、脑及其它动脉的循环障碍等疾病[1]。关于硫酸氢氯吡格雷原料药检测方法的报道非常少。为了更有效地控制硫酸氢氯吡格雷原料药的质量，作者建立了测定原料药中硫酸氢氯吡格雷及有关物质含量的HPLC方法。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

硫酸氢氯吡格雷对照品(纯度99.9%)、硫酸氢氯吡格雷原料药(批号：20090401、20090402、20090403)，沈阳医学院药物中心；甲醇(色谱纯)，天津市四友精细化学品有限公司；三乙胺(分析纯)。

UV200Ⅱ型高效液相色谱仪，大连依利特科学仪器有限公司；SunRun Express色谱数据工作站(EC2000)；AUY-120型电子天平，岛津-上海公司。

1.2 方法[2～4]

1.2.1 对照品溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的硫酸氢氯吡格雷对照品25.0 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为对照品贮备液。

1.2.2 供试品溶液的配制

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料药32.7 mg(约相当于氯吡格雷25 mg)，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：SinoChrom ODS-BP柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)(大连依利特科学仪器有限公司)；流动相：1%(体积分数)三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)；检测波长225 nm；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL。

1.2.4 HPLC测定

精密量取测试溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录HPLC图谱。理论板数按硫酸氢氯吡格雷峰计算不低于5000，分离度>1.5。

2 结果与讨论

2.1 HPLC图谱(图1)

由图1可知，在1.2.3色谱条件下硫酸氢氯吡格雷样品的保留时间为7.54 min(标准品的保留时间为7.56 min)，峰形良好，无杂质峰干扰。

2.2 线性关系

分别精密量取对照品贮备液0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按1.2.3色谱条件测定峰面积分别为740.96、836.20、928.56、1020.30、111.56。以浓度为横坐标(x,mg· mL-1)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。拟合线性回归方程为y=1542.2x+2.216，R=0.9999，表明硫酸氢氯吡格雷检测量在0.032～0.048 mg· mL-1范围内线性关系良好。

图1 对照品(a)和样品(b)的HPLC图谱

2.3 溶液的稳定性

精密量取供试品溶液1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度,摇匀。室温放置，分别于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h 、6 h、8 h、12 h按1.2.3色谱条件重复进样。硫酸氢氯吡格雷峰面积的RSD为0.44%，表明样品溶液12 h内稳定。

2.4 精密度

精密称取同一批样品(20090402)约32.7 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按1.2.3色谱条件重复进样6次。硫酸氢氯吡格雷的平均含量为99.5%，RSD为0.42%(n=6)。表明方法的精密度良好。

2.5 重复性

精密称取同一批样品(20090402)约32.7 mg，连续称定6份，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按1.2.3色谱条件平行测定6次。硫酸氢氯吡格雷的平均含量为99.6%，RSD为0.36%(n=6)。表明方法的重复性良好。

2.6 回收率

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料药约26.1 mg、32.7 mg、39.2 mg各3份，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声助溶20 min，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取硫酸氢氯吡格雷对照品约25 mg，置25 mL量瓶中，再精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按1.2.3色谱条件测定，按外标法由峰面积计算回收率。结果见表1。

表1 回收率实验结果

由表1可知，3个浓度下平均回收率为100.0%，RSD为0.63%(n=9)。

2.7 样品含量测定

精密称取3批硫酸氢氯吡格雷原料药32.7 mg(约相当于氯吡格雷25 mg)，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取硫酸氢氯吡格雷对照品25.0 mg，同法测定。原料药中硫酸氢氯吡格雷含量见表2。

表2 原料药中硫酸氢氯吡格雷及有关物质含量测定

2.8 有关物质测定

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料药适量，加甲醇溶解并稀释制成2 mg·mL-1的溶液作为供试品；精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释成20 μg·mL-1的溶液作为对照溶液。精密量取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰的峰高约为记录仪满量程的20%～25%，记录色谱图；再精密量取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积和，不得大于对照溶液主成分的峰面积。原料药中有关物质检测结果见表2。

2.9 流动相的优化

考察了流动相中乙腈与三乙胺配比对硫酸氢氯吡格雷出峰时间的影响，发现增大乙腈比例有利于缩短保留时间，当三乙胺∶乙腈为25∶75时，保留时间在8 min左右，能满足含量测定的快速要求。同时考察了流动相pH值对拖尾因子的影响，发现减小pH值有利于消除拖尾，这可能是因为酸性条件可抑制组分的解离，增大中性分子存在的几率，增加组分在固定相中的溶解度，从而减少拖尾。当pH=4.0时，拖尾因子在0.95～1.00之间。因此，选择流动相为1%(体积分数)三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)。

3 结论

建立了测定原料药中硫酸氢氯吡格雷及有关物质含量的HPLC方法。色谱柱为SinoChrom ODS-BP(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为1%(体积分数)三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)，流速1.0 mL·min-1；检测波长225 nm，进样量20 μL。结果表明，硫酸氢氯吡格雷在0.032～0.048 mg· mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(R=0.9999)，平均回收率为100.0%，RSD为0.63%(n=9)。该法操作简便、灵敏、准确度高，可用于硫酸氢氯吡格雷原料药的质量控制。

参考文献：

[1] 郑虎.药物化学(第六版)[M].北京：人民卫生出版社,2007:164-165.

[2] Mitakos A,Panderi I.A validated LC method for the determination of clopidogrel in pharmaceutical preparations[J].J Pharm Biomed Anal,2002,28(3-4):431-438.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典二部附录(2005年版)[M].北京：化学工业出版社，2005：28-30.

[4] WS1-(X-471)-2003Z,硫酸氢氯吡格雷[S].