补骨脂及双氢青蒿素杀灭隐孢子虫的观察

车 頔,应 超,李秀英,金小翠,秦元华,崔 昱

隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)主要寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内,可导致人体严重腹泻,对人类的身体健康造成严重的危害。目前对隐孢子虫病尚无特效抗虫药,但鉴于隐孢子虫病发病特点与免疫功能密切相关,因此,治疗中应兼顾提高免疫力与抑杀虫体。本实验选用补骨脂与双氢青蒿素二者配伍治疗隐孢子虫病鼠,期望为隐孢子虫病免疫及中药防治提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠60只,雌雄各半,体重28～32g(购自大连医科大学实验动物中心)。连续3d粪检均无隐孢子虫卵囊排出。

1.2 主要试剂与仪器地塞米松磷酸钠注射液(批号:0705121,5mg/mL,泗水希尔康制药有限公司),补骨脂(市售中草药,自制水煎剂,20g/100mL),双氢青蒿素粉剂(陕西森弗生物技术有限责任公司)。

扫描电镜(JSM-6360LV,日本),透射电镜(JEM-2000EX,日本)。

1.3 实验动物处理 60只小鼠随机分成5组(每组12只,雌雄各半,雌雄分开):A组为正常对照组;B组为模型组;C组为补骨脂治疗组;D组为双氢青蒿素治疗组;E组为补骨脂与双氢青蒿素合剂治疗组,并按治疗1～ 2w 时间分成 A1、A2;B1、B2;C1、C2;D1、D2;E1、E2共计 10组。除 A 组外,其余各组小鼠每w2次经腹股沟皮下注射0.05mL地塞米松磷酸钠注射液(浓度5mg/mL),同时采用改良抗酸染色法观察小鼠粪便中是否出现隐孢子虫卵囊。4w后,各组小鼠粪便中均有卵囊出现。停止地塞米松磷酸钠注射,开始进行中药治疗。

A组每d灌服1次蒸馏水(0.5mL/只),药物治疗组C、D、E分别灌胃给药(自制补骨脂药剂的浓度为20%(3.4g/kg);双氢青蒿素剂量 60mg/kg;合剂组为补骨脂与双氢青蒿素剂量各半,灌胃前混合,每d 1次。

每d观察小鼠的一般状态,包括毛色、摄食、活动、体重等。1w后每组随机取出3只雌性和3只雄性小鼠,将小鼠断颈处死,取十二指肠与空肠交界处约1cm的小肠组织进行病理学以及超微结构的观察。中药治疗2w后,重复上述方法留取待测标本。

1.4 光镜样品的制备及观察 将留取的小肠标本置于中性福尔马林固定12h后将样品修块、石蜡包埋、HE染色,镜检、记录和显微照相。

1.5 扫描电镜样品的制备观察 根据石蜡切片结果取舍电镜样品,十二指肠与空肠的角交界处肠组织1cm,循长轴剖开,置PBS漂净肠内容物后。在观察前,再用新手术刀片修块,修成2～3mm大小的组织块,然后用 30%、50%、70%、80%、90%乙醇、2份无水乙醇以及醋酸异戊酯在微波炉中逐渐脱水1min;再进行CO2干燥,粘块,喷金,最后在JSM-6360LV型扫描电镜下观察,拍照。

1.6 透射电镜样品的制备及观察 将小鼠断颈处死,立即置于冰袋上,取盲肠以上约2cm处新鲜的回肠组织,修成1～2mm3大小的组织块,立即置于2.5%的戊二醛中,预固定2h,OsO4后固定2h,梯度乙醇及丙酮脱水,EPON812环氧树脂包埋,超薄切片,乙酸铀-柠檬酸铅双染色,在透射电镜(JEM-2000EX)下观察,拍照。

2 结 果

2.1 小鼠一般状况观察以及排卵囊规律 正常对照组:精神状态和食欲良好,运动活跃,毛发顺滑而有光泽。阳性对照组:精神萎靡,活动减少,毛色晦暗,体重下降,出现腹泻,甚至死亡。药物治疗组:活动日趋频繁,食欲及体重增加,状态逐渐好转。

经过1W和2W的治疗,所有药物治疗组小鼠的粪便卵囊量与阳性对照组相比,均明显减少(P＜0.05),而且合剂治疗组明显低于单剂治疗组(P＜0.05)。随着治疗时间的延长,药物治疗组C2、D2的排卵囊量分别低于C1、D1(P＜0.05)。双氢青蒿素治疗组D1、D2排卵囊量分别明显低于补骨脂治疗组C1、C2(P＜0.05)。见图 1、表1。

表1 隐孢子虫病鼠粪检卵囊的变化Table 1 The number of oocysts in feces in mice infected with Cryptosporidium parvum

2.2 组织学观察

2.2.1 病理组织学观察 1w治疗组,A1组小肠绒毛整齐规则,上皮细胞及腺体结构清晰;B1组小肠上皮有缺损样改变,结构不完整,可见大量炎性细胞和淋巴细胞浸润;C1组小肠黏膜组织仍可见少量坏死灶,腺体排列较整齐,回肠充血,固有层有大量的炎症细胞浸润;D1组小肠黏膜组织修复中,出现的坏死区域变小或减少;E1组小肠黏膜上皮及腺体结构逐渐完整,坏死灶少见。

2w治疗中,A2组小肠绒毛结构正常,上皮细胞完好;B2组上皮细胞缺损,细胞排列不整,空肠部分肠黏膜已脱落呈火山口状;C2组黏膜组织坏死恢复,坏死灶少见;D2组黏膜恢复较好,腺体及上皮排列整齐;E2组小肠绒毛结构及腺体完好,恢复较好。

2.2.2 扫描电镜观察 正常对照组:A1和A2组均可见微绒毛完整,排列整齐、紧密,无脱落现象。

阳性对照组:B1组可见隐孢子虫滋养体似图钉样深嵌于微绒毛丛内,虫体大小不一。微绒毛较为完整,无倒伏,萎缩和脱落现象;B2组可见小肠上皮细胞寄生有大量的虫体,球形或椭球形,呈现出微绒毛脱落、倒伏,排列紊乱现象,虫体周围微绒毛丛稀疏,有些甚至找不到微绒毛。上皮细胞大量增殖坏死。

治疗组:补骨脂治疗C1组可见小肠微绒毛完整,无倒伏,但仍有少量虫体寄生于完整的微绒毛从中;C2组中寄生的虫体大小不等,数量很少,微绒毛无脱落现象。双氢青蒿素治疗组D1可见寄生虫体极少,所见虫体大小均匀一致,虫体周围的微绒毛完整,排列整齐;D2组没发现虫体,微绒毛排列整齐。合剂治疗组E1可见微绒毛整齐,偶见1虫体,形态不规则;E2组没找到虫体,微绒毛完整。见图2。

2.2.3 透射电镜观察 正常对照组:A1和A2组均可见小肠绒毛上皮细胞形态正常,结构完整,大小一致。细胞边缘清晰整齐,细胞连接紧密。表面有大量的微绒毛,排列整齐,分布均匀。

阳性对照组:B1组可见上皮细胞遭到破坏,形状不规则,细胞连接不整齐,可见细胞肿胀,有些细胞呈短柱状。细胞排列不整,杯状细胞减少;B2组上皮细胞肿胀、微绒毛稀疏、倒伏,并出现断裂和脱落严重等病征。可见小鼠隐孢子中期滋养体嵌于肠上皮细胞的刷状缘,细胞膜下,细胞质外。

治疗组:与模型组B1相比,3个治疗组C1、D1、E1的小鼠小肠黏膜超微结构均未见微绒毛倒伏,断裂,脱落;与 B2相比,治疗组 C2、D2、E2 小肠上皮细胞状态明显好转,细胞排列趋于整齐。细胞连接复合体正常,细胞连接未见松散,见图3。

图1 隐孢子虫卵囊(CP)(粪便,改良抗酸染色 ×1 000)Fig1 C.parvum oocysts(feces,modified acid fast stain ×1 000)

图2 各组扫描电镜结果Fig.2 Result of scanning electron microscope

4 讨 论

中药补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实,性温,味辛,具有温肾助阳、纳气、止泻等功效〔1〕,是临床常用药。崔昱等〔2-3〕用补骨脂与鸦胆子合剂治疗大鼠卡氏肺孢子虫肺炎,结果表明补骨脂可明显提高宿主免疫力,有较强的抵抗氧自由基作用。很多科学实验也证实了补骨脂可提高小鼠特异性体液免疫以及机体非特异性免疫力及应激态小鼠体液免疫〔4-5〕。青蒿素为菊科黄花蒿植物的提取物,能杀灭疟原虫,治疗疟疾,还可治疗弓形虫病、血吸虫病、卡氏肺孢子虫肺炎等〔6-9〕。双氢青蒿素(Dihydroarteannuin,DHA)为青蒿素类在体内最终的有效形式,也有调节机体免疫功能的作用〔10〕,有学者实验证实DHA可通过作用于阴道毛滴虫微丝结构,破坏其结构和功能,达到抑杀虫,清除感染的目的〔11〕;DHA还可对蓝氏贾第鞭毛虫的质膜及细胞骨架产生较强的损伤作用,达到抑杀虫体的目的〔12〕;而隐孢子虫的细胞骨架蛋白在虫体的运动和侵入宿主的过程中发挥重要作用〔13〕。因此,我们可利用DHA药学机制来控制隐孢子虫的感染及防止疾病的发生。

图3 各组透射电镜结果Fig.3 Result of transmission electron microscope

本实验研究通过对隐孢子虫感染小鼠中药治疗前后体质变化、卵囊排出量以及肠壁黏膜组织病理及超微结构变化动态观察,发现中药补骨脂、双氢青蒿素以及二者合剂组对隐孢子虫病的治疗效果是令人满意的。在抑杀虫效果方面,合剂治疗组优于单剂治疗组;双氢青蒿素组优于补骨脂组;2w组优于1w组,表明较长时间的稳定持续治疗明显有助感染控制及免疫应答反应能力的提高。阳性对照组的小肠,在15 000,20 000倍扫描电镜下观察,可见上皮细胞有大量虫体寄生,呈球形或椭球形的虫体似图钉样寄居于微绒毛丛中,大量虫体覆盖于小肠微绒毛上皮的表面,溶噬肠壁黏膜,致使微绒毛倒伏、脱落,严重影响其营养的吸收。而与相应的阳性对照组相比,所有治疗小鼠黏膜上皮细胞处于修复之中,上皮细胞的细胞连接趋于整齐,微绒毛趋于直立及完整。尽管在1w治疗组中尚存少量还没有完全修复的病灶,并且在这些病灶中发现个别残存的滋养体,其周围的微绒毛已开始修复紧密、整齐,较少有倒伏、肿胀和脱落的现象。经过2周后各治疗组小鼠几乎找不到隐孢子虫的寄生,由此可见这两种中药对隐孢子虫的感染和治疗有较为明显的疗效,而且二者具有协同抑杀虫体、提高机体免疫力,以抵御隐孢子虫感染与致病的作用。

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